龙胆中黄酮化合物含量测定的方法学研究

朱丹 杨菁 李林龙 杨航 黎燕

摘要[目的]建立紫外可见分光光度法测定龙胆中总黄酮含量的方法。[方法]通过微波辅助双水相提取龙胆中总黄酮类化合物，采用紫外可见分光光度法，以芦丁作为对照品，测定其含量。[结果]黄酮类化合物浓度在10.4～73.0 μg/mL，其吸光度与浓度有良好的线性关系；该方法的精密度、重复性和加樣回收率的RSD值分别为0.30%、1.31%、2.27%。[结论]该方法准确、快速、重复性好，可以用于测定龙胆中总黄酮类化合物。

关键词龙胆；黄酮化合物；紫外可见分光光度法；含量测定；方法学

中图分类号S567.23文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0113-02

Abstract[Objective] The research aimed to establish a method for determination of the total flavonoids from Radix Gentianae.[Method]The total flavonoids in Radix Gentianae were extracted by microwaveassisted aqueous twophase. The contents of total flavonoids were determined by UV-visible spectrophotometry with rutin as the reference substance. [Result]The method was a good linear at the range of 10.4-73.0 μg/mL of the total flavonoids. The RSD values of the precision test， reproducibility experiment and the recovery rate test were 0.30%，1.31%，2.27%，respectively.[Conclusion]The method is accurate， rapid and reproducible，and can be used to determine the total flavonoids from Radix Gentianae.

Key wordsRadix Gentianae；Flavonoids；UVvisible spectrophotometry；Determination of content；Methodology

龙胆（Radix Gentianae）为龙胆科植物条叶龙胆（Gentiana manshurica Kitag.）、龙胆（G.scabra Bge.）、三花龙胆（G. triflora Pall.）、坚龙胆（G.rigescens Franch）的干燥根及根茎，味苦、寒，具有清热燥湿、泻肝胆火的功效[1]。近年来研究表明，龙胆的地上部分含有黃酮类化合物[2-3]，具有抗炎、抗菌、降血糖等药理活性[4]。该试验采用紫外可见分光光度法对龙胆中的总黄酮进行含量测定，并对其方法学进行考察[5-6]。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验仪器。UV-500紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），M1-211A微波炉（美的公司），AR2140电子分析天平（上海奥豪斯有限公司），DRHH数显恒温水浴锅（上海双捷实验设备有限公司）。

1.1.2试验试剂。龙胆药材（产地：广西）；芦丁对照品（上海永恒生物科技有限公司，纯度>98%）；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、硫酸铵等试剂均为分析纯。

1.2试验方法

1.2.1供试品溶液的制备。准确称取干燥至恒重的药材0.25 g 于圆底烧瓶中，加入20 mL 35%乙醇-20%硫酸铵双水相提取剂，摇匀，置于微波炉中。在功率420 W下萃取25 min。静置，待溶液分相后，取出上相在60 ℃下水浴挥干，残渣用甲醇溶解，定容至10 mL，作为供试品溶液。

1.2.2芦丁对照品溶液的制备。精密称取芦丁对照品20.85 mg置于100 mL容量瓶中，加入无水乙醇溶液、摇匀，稀释至刻度，配制成0.208 5 mg/mL对照品溶液。

1.2.3测定波长的选择。精密吸取一定量的芦丁对照品溶液和供试品溶液于2个10 mL的容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液4 mL，后用无水乙醇定容至刻度，摇匀，以相应试剂作为空白对照，在200～800 nm波长进行扫描，选择最佳测定波长。

1.2.4方法学考察。

1.2.4.1线性关系考察。精密吸取“1.2.2”的芦丁对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，置于10 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法，自“分别加入5%亚硝酸钠溶液”起依法测定其吸光度，以标准溶液浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4.2稳定性试验。精密吸取“1.2.2”的芦丁对照品溶液和“1.2.1”的供试品溶液各1.0 mL，按照“1.2.3”方法，自“分别加入5%亚硝酸钠溶液”起，分别在0、5、10、15、20、25、30 min测定其吸光度，计算相对标准偏差（RSD）值。

1.2.4.3精密度试验。精密吸取“1.2.1”的供试品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法，自“分别加入5%亚硝酸钠溶液”起依法测定吸光度，连续测定6次，计算RSD值。

1.2.4.4重复性试验。准确称取干燥的龙胆药材0.25 g各6份，按“1.2.1”方法进行提取制备。精密吸取1.0 mL提取液，按“1.2.3”方法进行测定，并计算RSD值。

1.2.4.5加样回收率试验。准确称取干燥的龙胆药材0.25 g各6份，分别加入一定量的芦丁对照品，按“1.2.1”方法进行提取，精密吸取1.0 mL提取液，按“1.2.3”方法进行测定，计算总黄酮的回收率。

2结果与分析

2.1测定波长的选择按照“1.2.3”操作，结果表明，对照品与样品溶液在505 nm处有最大吸收，故选择505 nm为最佳测定波长。

2.2线性关系考察按照“1.2.4.1”操作，以标准溶液浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得出标准曲线方程为A=10.68C-0.002（R2=0.999），表明芦丁对照品在10.4～73.0 μg/mL其吸光度与浓度呈良好的线性关系。

2.3稳定性按照“1.2.4.2”操作，发现芦丁对照品和药材提取液显色后在30 min内稳定，其RSD值分别为0.22%和0.30%，表明芦丁对照品和提取液中的黄酮类化合物在30 min内保持稳定。

2.4精密度按照“1.2.4.3”操作，计算得RSD值为0.30%，表明仪器精密度良好。

2.5重复性按照“1.2.4.4”操作，计算RSD值为1.31%，表明该方法的重复性好。

2.6加样回收率由表1可知，平均回收率为99.6%，RSD值为2.27%，说明该方法回收率高，满足分析测定的要求。

3结论与讨论

紫外可见分光光度法具有灵敏度高、准确度高、操作简单、应用广泛等特点。该试验采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色剂与龙胆中总黄酮发生络合反应，生成稳定的吸光物质，通过紫外可见分光光度法对龙胆中的总黄酮含量进行测定，考察了方法的精密度、重现性及加样回收率，测定结果的RSD值均在要求的范围之内，表明该方法稳定、准确、操作简便，可以用于龙胆中总黄酮含量的测定。

参考文献

[1] 张敬莹.糙龙胆地上部分的化学成分研究[D].大连：大連理工大学，2008.

[2] 江蔚新，安胜利，郭立萍，等.龙胆地上、地下部分药理作用的比较分析[J].哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2003，19（1）：14-16.

[3] 赵磊，李智敏，白艳婷，等.滇龙胆地上部分的化学成分研究[J].云南中医学院学报，2009，32（2）：27-31.

[4] 刘涛，才谦，付玉芹，等.中药龙胆的研究进展[J].辽宁中醫杂志，2004，31（1）：85-86.

[5] 刘春雨，王集会.发酵蜈蚣粉中总黄酮类含量测定的方法学研究[J].安徽农业科学，2016，44（17）：154-155.

[6] 倪晓霞，王庆芬，魏浩泽，等.紫外分光光度法测定蒲地灌肠液中总黄酮含量[J].中医药导报，2017，23（2）：57-59.