濒危药材金线莲愈伤组织诱导及分化成苗研究

许晴 穆梁丽 冀爱青

摘要[目的]建立有效的濒危药材金线莲的再生体系，为其工厂化生产奠定技术基础。[方法]选取福建金线莲的叶片、茎片、带节茎段、不定芽为外植体，建立无菌体系，而后以愈伤组织的诱导率为指标，采用正交设计优化不同外植体各阶段（愈伤组织的诱导和分化）培养基中激素的种类及浓度。[结果]在试验的福建金线莲4种外植体中，不定芽的愈伤組织诱导率最高，可达96.67%，其最适培养基配方为MS+0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L BA+0.3 mg/L KT。在此培养基上，诱导的愈伤组织在分化培养基MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L BA和增殖培养基MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA上继代形成了无根试管苗。[结论]该研究建立的无菌繁殖体系，解决了前人所指出的金线莲愈伤组织诱导率极低的瓶颈问题，组培成苗的效率有较大提高。

关键词金线莲；不定芽；愈伤组织；分化成苗

中图分类号S567.23+9文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0103-04

Abstract[Objective] The research aimed to establish an effective recycling system for Anoectochilus roxburghii， and lay the technical foundation for its industrial production. [Method] As explant of leaf， stem， stem segment with node and adventitious bud of Anoectochilus roxburghii， the aseptic system was established， and then the induction rate of callus was used as an index to optimize the type and concentration of hormones in the culture medium of different explants （callus induction and differentiation） by orthogonal design.[Result]In the test of Anoectochilus roxburghii， four explants， the callus induction rate of adventitious bud was the highest， up to 96.67%， the optimum medium formula was MS+0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L BA+0.3 mg/L KT. On the basis of the medium， the callus was subcultured on the differentiation medium（MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L BA） and the proliferation medium （MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA） to form a rootless test tube.[Conclusion]Asepsis reproductive system has been established， which solves the bottleneck problem that the predecessors pointed out that the callus induction rate of Anoectochilus roxburghii was very low，the efficiency of tissue culture seedlings have greatly improved.

Key wordsAnoectochilus roxburghii；Adventitious buds；Callus；Seeding differentiation

金线莲[Anoectochilus roxburghii（Wall.） Lindl]，别名金丝线、金耳环等，兰科开唇兰属多年生草本植物。金线莲是我国珍稀濒危的名贵药材，素有“药中之王”之称，其全草均可入药，有清热凉血、祛风利湿、解毒、止痛、镇咳等功效。近年来，金线莲在治疗高血压、糖尿病及肿瘤等疑难病症方面日益引起医药界的重视，具有广阔的开发利用前景。金线莲的种子不易萌发，用传统的实生繁殖相当困难，且其栽培对生态环境要求严格，加之自然环境遭受严重破坏，生长极其缓慢，且虫鸟等动物喜食，自然资源稀少，导致市场价格昂贵，高达3 000～5 000元/kg，不利于金线莲的推广。而植物组织培养技术作为一种无性繁殖的手段，可在短期内提供大量优质的试管苗，使其大面积推广成为可能。目前，金线莲的快速繁殖主要通過原球茎和丛生芽进行培养物的大量繁殖[1-6]，而对愈伤组织的研究却鲜见报道。因为茎段受腋芽影响不能大量扩增，并且外植体的数目也有限，光靠原球茎和丛生芽进行组织快繁远不能满足市场需求。利用愈伤组织来培养可以对植物进行快速繁殖，同时，也对植物改良、种质保存有很大作用，这样使得金线莲的繁殖速度得到了最大化的提升。该试验采用金线莲的不同组织（叶片、茎片、茎段及不定芽）作为外植体材料，通过愈伤诱导、分化、继代、生根4个阶段培养，形成大量优良试管苗，为金线莲的规模化生产提供可靠的技术保障。

1 材料与方法

1.1供试材料选择生长旺盛、无病虫害的健壮金线莲植株，摘取叶片、茎作为供试外植体材料。

1.2材料处理软毛刷刷净叶片、茎段、不定芽材料表面，放入小烧杯中罩上纱布后，流水冲洗30 min左右，置于超净工作台上，在75%酒精中浸泡30 s后，倒去酒精，再用0.1%HgCl2灭菌8 min，无菌水冲洗5～7次。将叶片切成0.5 cm2左右小块，茎段切成1 cm左右小段和2 mm左右厚度的薄片，不定芽切下即可，无菌条件下接入准备好的培养基中培养。每瓶接4～6个外植体。

1.3培养基及培养方法以MS为基本培养基，以蔗糖30 g/L为碳源，用琼脂4.2 g/L固化，pH调至5.8附加不同浓度水平的植物激素。分装后，在121 ℃下湿热灭菌20 min，放入无菌操作室。用SPSS软件对6-BA、NAA、KT 3个因素多个浓度水平进行正交设计，并计算出诱导率：愈伤组织诱导率= 诱导愈伤组织数/接种外植体数×100%。

1.4培养条件温度22～26 ℃，光照时数12 h/d，光照强度2 000 lx。

2结果与分析

2.1金线莲叶片诱导愈伤组织从表1可以看出，正交设计的三因素三水平的9个处理均未诱导出愈伤组织。

2.2金线莲茎片诱导愈伤组织从表2可以看出，正交设计的三因素三水平的9个处理愈伤组织诱导率不同，其中处理5诱导率最高，达13.33%。根据极差分析得知，影响金线莲茎片诱导愈伤组织最重要的激素为NAA，且最适配比为NAA（2）+BA（3）+KT（3），即0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。

2.3金线莲茎段诱导愈伤组织从表3可以看出，正交设计的三因素三水平的9个处理愈伤组織诱导率明显不同，其中处理5诱导率最高，达54.44%。根据极差分析得知，影响金线莲茎段诱导愈伤组织最重要的激素为NAA，且最适配比为NAA（2）+BA（3）+KT（3），即0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。

2.4金线莲不定芽诱导愈伤组织从表4可以看出，正交设计的三因素三水平的9个处理愈伤组织诱导率存在显著差异，其中处理5诱导率最高，达96.67%。根据极差分析得知，影响金线莲不定芽诱导愈伤组织最重要的激素为NAA，且最适配比为NAA（2）+BA（2）+KT（3），即0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。由图1可知，不定芽接种在最适培养基中13 d，不定芽开始膨胀扩张，出现瘤状结构的小突起，呈奶黄色，有光泽；不定芽接种在最适培养基25 d，瘤状突起不断扩大增加，形成大块的愈伤组织，颜色呈青绿色，其顶部可见的球状的乳白色突起；经过反复继代后，愈伤组织逐渐变小，4～5代后愈伤组织质地松散，透明。

2.5金线莲不定芽愈伤组织分化成苗将不定芽愈伤组织切块接到不同的分化培养基上进行培养，一段时间后观察发现愈伤组织切块边缘出现不同数量的棕红色芽点，第16天芽点地方长成小芽（图2a），小芽继续生长发育形成小苗（图2b），然后将无根试管苗在增殖培养基MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA上继代移栽（图3）。

3结论与讨论

采用叶片、茎段、茎片及不定芽4种不同外植体诱导愈伤组织，发现不定芽的愈伤组织诱导率最高，可达96.67%，其次为茎段和茎片，最高诱导率分别达54.44%和13.33%；而叶片并未诱导出愈伤组织。其不定芽、茎段、茎片诱导愈伤组织较适的培养基分别为MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L BA、0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT和0.5 mg/L NAA+5.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L KT。

在以往的关于金线莲组织培养的研究中，原球茎及丛生芽诱导的报道较多，但以不同外植体诱导愈伤组织则鲜见报道。该试验得出采用不定芽作为外植体比叶片、茎段、茎片3种外植体的诱导率高，究其原因可能与不定芽在4种外植体中的分生能力最强有关，这与王雅英等[3]的研究结果一致。该试验中，叶片并未诱导出愈伤组织，且研究仅限于愈伤组织的诱导、分化方面，在植株生根及愈伤组织诱导培养基优化等方面还有待进一步研究。

参考文献

[1] 张福生，郭顺星.SPSS正交设計在福建金线莲组织培养中的应用[J].中国中药杂志，2009，34（20）：2581-2585.

[2] 韩晓红，王春龙，段春红.不同激素水平对金线莲组织培养的影响[J]. 广东农业科学，2012（18）：94-97.

[3] 王雅英，林小华，洪璇.金线莲外植体筛选及愈伤组织诱导研究[J].亚热带植物科学，2011，40（3）：41-43.

[4] 黄勇.金线莲组织培养新体系建立及优化[J].北方园艺，2010（13）：178-179.

[5] 范子南，肖华山，范晓红，等.金线莲的组织培养研究[J].福建师范大学学报（自然科学版），1997，13（2）：82-87.

[6] 杨红丽，胡靖锋，徐学忠，等.金线莲的组织培养与快速繁殖研究[J].西南农业学报，2013，26（6）：2485-2488.