产甘草苷内生真菌HGE5的鉴定及抑菌活性研究

李伟 白长胜 郑雪 郑春英

摘要[目的]研究甘草内生真菌HGE5及其活性代谢产物，为深入开发利用该菌株提供依据。[方法]选取12种受试致病菌，测定内生真菌HGE5的抑制活性，并采用形态特征观察法及rDNA ITS 序列同源性分析对内生真菌HGE5进行鉴定，利用HPLC法对HGE5发酵液进行分析。[结果]甘草内生真菌HGE5对8种受试致病菌有较强的抑菌作用，内生真菌HGE5为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）；该菌发酵液中含有甘草苷。[结论]HGE5是甘草苷产生菌，该菌的获得可为甘草苷成分的生产提供新方法。

关键词内生真菌；鉴定；抑菌活性；甘草苷

中图分类号R931文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0100-03

Abstract[Objective] The research aimed to study the endophytic fungi HGE5 from Glycyrrhiza uralensis and its active metabolites，and provide the basis for further development and utilization of the strain.[Method]The inhibitory activity of endophytic fungi HGE5 was determined by 12 kinds of pathogenic bacteria.The endophytic fungi HGE5 was identified by morphological observation and rDNA ITS sequence homology analysis.The fermentation broth of HGE5 was analyzed by HPLC.[Result]The endophytic fungus HGE5 had strong antibacterial activity against eight kinds of pathogenic bacteria.The endophytic fungus HGE5 was Fusarium oxysporum.The fermentation broth contained licorice.[Conclusion]HGE5 is a Liquiritinproducing endophytic fungus，which provides a new method for the production of Liquiritin.

Key wordsEndophytic fungus；Identification；Antimicrobial activity；Liquiritin

作為新興的微生物资源，植物内生菌不仅能够产生一些特殊复杂多样的活性代谢物，还能产生与宿主植物相同或相似或全新的活性代谢物[1]。因此，将植物内生菌作为发酵菌株，利用发酵法工厂化生产宿主植物中的某些活性成分，不仅可以开发新资源，有利于植物资源的可持续利用；同时，微生物发酵法生产药物或食品时，可显著缩短生产周期、降低生产成本，并可通过控制发酵参数、诱变育种等措施来提高其活性成分的产率，因此微生物发酵法生产食品、药物应用前景十分广阔[2]。

有研究发现，乌拉尔甘草内生真菌HGE5发酵液中含有甘草主要活性成分甘草苷，该化合物结构类型为黄酮类化合物[3]，具有明显的抗过敏、抗氧化[4]、抗癌、神经保护、免疫调节、降血糖[5]等药理活性，是食品、医药重要的生产原料。笔者选取12种受试致病菌，测定内生真菌HGE5的抑制活性，并采用形态特征观察法及rDNA ITS 序列同源性分析对内生真菌HGE5进行鉴定，利用HPLC法对HGE5发酵液进行分析，系统地研究甘草内生真菌HGE5及其活性代谢产物，为深入开发利用该菌株提供依据。

1材料与方法

1.1菌种与培养

1.1.1供试菌。内生真菌HGE5是分离自野生乌拉尔甘草根部（采集地是黑龙江省帽儿山地区）。

1.1.2受试致病菌。A：大肠杆菌（Escherichia coli）；B：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；C：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；D：短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）；E：铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa）；F：单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）；G：肺炎克雷伯菌（Klebsiella penumoniae）；H：鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）；I：酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）；J：屎肠球菌（Enterococcus faecium）；K：粪肠球菌（Enterococcus facalis）；L：白假丝酵母（Candida albicans）。以上12株菌株购于黑龙江省微生物研究所，现保存于黑龙江大学生物制药专业实验室。

1.1.3PDA培养基。配方组成及配制方法见参考文献[6]。

1.2仪器与试剂FL2200高效液相色谱仪（产地是浙江温岭）。真菌基因组 DNA快速抽提试剂盒及真菌 ITS 区扩增通用引物（上海生工生物工程股份有限公司合成）。乙腈为色谱纯级别，其他试剂均为分析纯。

1.3内生真菌HGE5抑菌活性试验参考文献[7]采用滤纸片法进行抑菌活性测定。将已活化的HGE5单菌落接种于 PDA 液体培养基中，置于摇床，培养条件：28 ℃、140 r/min、7 d。取HGE5发酵液，50 ℃减压蒸干，适量甲醇溶解后作为供试品（质量分数为0.2 mg/mL），以0.22 μm无菌滤器过滤后测定其抑菌活性（n=6）。

1.4内生真菌HGE5的鉴定

1.4.1内生真菌HGE5形态学鉴定。无菌条件下，挑取HGE5的菌丝转接于PDA培养基（平板）中间位置进行培养（28 ℃，7 d），观察形态特征（菌落大小、颜色、质地等）；同时将活化后的HGE5菌种接种于PDA平板中培养（28 ℃，2 d），将灭菌盖玻片倾斜插入PDA平板中，继续培养（28 ℃，3 d），取出平板，小心镊取盖玻片，除去背面附着物，观察HGE5菌株的孢子显微特征（形态、结构等），结合文献[8]中的分类指标，初步确定菌株的分类地位。

1.4.2内生真菌HGE5 ITS序列扩增及序列分析。ITS 区段的 PCR 扩增采用通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR 反应体系为10×PCR buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL、dNTP（10 mmol/L）0.5 μL、引物各1 μL，补充去离子水至25 μL，模板 DNA 1 μL，用超纯水定容至25 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min→95 ℃变性60 s→56 ℃退火60 s→72 ℃延伸 120 s→30个循环→72 ℃ 10 min。PCR 產物纯化后直接测序（测序工作委托上海生工生物工程股份有限公司完成）。测序后，将序列提交GenBank 数据库，ITS 序列使用 ClustalX 1.83 和 MEGA 4.1以近邻结合法（Neighborjoining）构建系统发育树，bootstrap检验值≥50%（1 000重复），确定目标菌株的分类地位。

1.5HGE5发酵液中活性成分分析取“1.3”项下制备的HGE5菌株发酵液，40 ℃真空减压抽干后，加入1 mL无菌水溶解，再以 0.45 μm 微孔滤膜过滤，取滤液，作为供试品溶液。采用HPLC法，分别精密吸取 0.5 mg/mL 的甘草苷对照品溶液及供试品溶液各 10 μL 注入HPLC仪器，HPLC检测条件为：Venusil XBP-C18柱（柱4.6 mm×250 mm，5 μm，USA）；流动相为乙腈∶冰醋酸∶水（20.0∶0.5∶79.5）；流速1 mL/min；柱温25 ℃；检测波长为276 nm。

2结果与分析

2.1HGE5菌株发酵液抑菌活性用12种受试致病菌（分别代表G+、G-及真菌）对菌株HGE5发酵液进行抑菌能力测定，结果表明（表1），甘草内生真菌HGE5发酵液对8 种受试致病细菌的生长有较强的抑制作用，对真菌白假丝酵母（Candida albicans）无抑制作用。

2.2内生真菌HGE5的鉴定

2.2.1内生真菌HGE5形态学鉴定。菌落白色，后中央变为深红色，菌丝密集，毡状，基质深红棕色（PDA固体培养基上培养7 d后，图1）；分生孢子梗单生或集成分生孢子座，细长或短粗，大型孢子多细胞，镰刀形，小型孢子单细胞，卵圆形（图2）。

2.2.2内生真菌HGE5 ITS序列扩增及序列分析。甘草内生真菌HGE5 DNA经PCR扩增获得1条 500 bp的特异性条带（图3），将测序结果在GenBank中进行BLAST同源性比对，然后用MEGA4.1软件构建系统发育树（图4），内生真菌HGE5 ITS序列（登录号：KF022041）与镰孢霉属菌Fusarium oxysporum GU565671.1的序列的同源性最高，相似性为97%。综合菌体形态学鉴定结果，确定甘草内生真菌HGE5为镰孢霉属菌（Fusarium oxysporum）。

发酵液中活性成分分析经HPLC分析发现，甘草内生真菌HGE5发酵液中疑似含有甘草苷，在“1.5”项色谱条件下，供试品色谱中，在与甘草苷对照品相同保留时间位置上有相同的色谱峰出现（图5），而在PDA空白培养基色谱图中未见该保留时间位置有任何色谱峰出现（图6a），且该色谱峰经过对照品加入法得到了较好的确认（图6b），从而排除了该色谱峰为PDA空白培养基中成分的可能性，说明该色谱峰为HGE5发酵液中特有成分——甘草苷。

3结论

以甘草内生真菌HGE5为研究对象，选取12株受试致病菌为指标，观察内生真菌HGE5的抑菌活性，结果表明，内生真菌HGE5对8株受试细菌有较强的抑菌活性，是潜在的可产生抑菌活性物质的内生菌；菌株HGE5经形态学特征鉴定及rDNA ITS序列分析结果，最终确定为镰孢霉属菌（Fusarium oxysporum）。

该研究首次从甘草内生真菌HGE5发酵液中发现甘草苷成分，说明内生真菌HGE5是甘草苷产生菌，甘草苷是食品、药品、化妆品重要的生产原料。目前，甘草苷的生产方法从甘草生药中提取，若将内生真菌HGE5作为出发菌株，从其发酵液中提取分离甘草苷成分，并确定可行的提取工艺，可为开发甘草苷活性成分的生产提供新方法、新资源。关于HGE5发酵液中活性成分的系统提取、分离鉴定工作还在进一步研究中。

参考文献

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