椎间盘退变患者髓核组织中HtrA1的表达及其与MMPs的关系

岳佳伟，李大鹏，吴燕，黄永辉

(1江苏大学附属医院，江苏镇江 212001；2江苏大学医学院)

椎间盘退变患者髓核组织中HtrA1的表达及其与MMPs的关系

岳佳伟1，李大鹏1，吴燕2，黄永辉1

(1江苏大学附属医院，江苏镇江 212001；2江苏大学医学院)

目的 观察椎间盘退变患者髓核组织中高温必需因子A1(HtrA1)的表达及其与基质金属蛋白酶(MMPs)的关系。方法 78例接受椎间盘髓核切除患者，其中年轻脊柱骨折患者(改良Thompson分级Ⅰ级)10例，椎间盘退变患者68例(改良Thompson分级Ⅱ级22例、Ⅲ级24例、Ⅳ级22例)。采用real-time PCR和Western blotting法分别检测椎间盘髓核组织中的HtrA1及MMP-1、3、7、9、13 mRNA和蛋白，并采用Pearson法分析HtrA1和MMP-1、3、7、9、13的相关性。结果 改良Thompson分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级患者椎间盘髓核组织中HtrA1 mRNA分别为0.56±0.49、0.70±0.45、1.47±0.86、4.10±1.17，蛋白分别为0.16±0.09、0.52±0.07、1.21±0.26、3.10±0.17，两两相比P均<0.05。不同改良Thompson分级患者椎间盘髓核组织中MMP-1、3、13的mRNA、蛋白表达两两相比P均<0.05。HtrA1 mRNA与MMP-1、3、13 mRNA表达呈正相关(r2分别为0.144 8、0.240 6、0.869 5，P均<0.01)。结论 椎间盘髓核组织中HtrA1的表达随椎间盘退变程度的升高而升高，且与MMP-1、3、13的表达有关。

椎间盘退变；高温必需因子A1；基质金属蛋白酶

椎间盘退行性疾病是临床上常见病，发病趋于年轻化，是导致颈肩腰腿痛的一个重要原因，椎间盘退变是椎间盘退行性疾病的病理学基础[1]，多种因素均可促进椎间盘退变的发生[2]，但具体的细胞分子机制尚不清楚。髓核是椎间盘的重要组成部分，由髓核细胞以及细胞外基质组成。髓核中的细胞外基质处于合成代谢与分解代谢的动态平衡，当细胞外基质分解过多时，髓核的水分将会流失，固有的弹性也将丧失，进而导致椎间盘生物力学功能减退[3]。高温必需因子A1(HtrA1)为丝氨酸蛋白酶家族成员，是一种分泌蛋白，可促进细胞外基质的分解[4]。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组需要Zn2+、Ca2+等金属离子作为辅助因子的同工酶，其功能为参与细胞外基质的降解，具有减少细胞外和基膜组分的作用。MMPs的上调可导致髓核变性，从而引起相应的椎间盘病变[5]。目前研究较多的参与椎间盘退变过程的MMPs为MMP-1、3、7、9、13。关于HtrA1在椎间盘退变中的作用目前研究较少，因此本研究观察了不同改良Thompson分级椎间盘髓核组织中HtrA1的表达情况，并探讨其与MMP-1、3、7、9、13表达的关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月～2016年1月在江苏大学附属医院行椎间盘髓核切除者78例，其中年轻脊柱骨折患者(改良Thompson分级Ⅰ级)10例，椎间盘退变患者68例(改良Thompson分级Ⅱ级22例、Ⅲ级24例、Ⅳ级22例)。所有患者术前无肿瘤、感染、炎症等。手术中切取所有患者椎间盘髓核组织中央部分。本研究经江苏大学附属医院医学伦理委员会审批，并与患者签订知情同意书。

1.2 椎间盘髓核组织中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13 mRNA表达检测 采用real-time PCR。取50～100 mg新鲜髓核组织，剪碎置入装有1 mL TRIzol试剂(Invitrogen公司)的研磨器中，迅速研碎。移至1.5 mL无菌进口EP管中，反复吹打，应用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取总RNA。采用核酸蛋白质检测仪检测RNA的浓度，并按Invitrogen公司逆转录试剂盒(18080-051)说明书合成cDNA，逆转录反应按照试剂盒说明进行。采用10 μL逆转录反应体系，其中包括总RNA 1 μL、MgCl22 μL、10×RT Buffer 1 μL、RNase Free dH2O 3.75 μL、dNTP(各10 mmol/L)1 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL、OligodT 0.5 μL。采用Oligo 6软件设计引物，所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA为模板，采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(DRR420A)进行荧光定量PCR反应，反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性5 s，于Tm值下退火延伸30 s，扩增40个循环。72℃延伸时采集荧光信号。以β-actin为内参，采用2-ΔCt法分析HtrA1及MMP-1、3、7、9、13 mRNA相对表达量。

1.3 椎间盘髓核组织中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13蛋白表达检测 采用Western blotting法。取20～40 mg新鲜髓核组织，剪碎，加入1 mL预冷的RIPA(含PMSF)裂解液，超声匀浆器匀浆后冰浴10 min，将匀浆液收集于EP管中，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。取上清，采用Bradford法测定总蛋白浓度，并按比例加入含β-巯基乙醇的Buffer，于沸水煮变性后置-20 ℃保存。凝胶电泳，转PVDF膜，滴加100 μL一抗[HtrA1兔单克隆抗体NBP2-23869(1∶500，Novusbio公司)、MMP-1兔单克隆抗体BS1229(1∶500，Bioworld Technology公司)、MMP-3兔单克隆抗体ab52915(1∶1 000，abcam公司)、MMP-7鼠单克隆抗体sc-8832(1∶200，Santa Cruz公司)、MMP-9鼠单克隆抗体ab58803(1:500，abcam公司)、MMP-13兔单克隆抗体ab39012(1∶3 000，abcam公司)]，4 ℃孵育过夜。TBST洗3次，滴加相应二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，用TBST洗3次。滴加ECL发光剂显色，于凝胶成像系统扫描条带，运用Image J软件分析扫描结果，计算目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 不同改良Thompson分级患者髓核组织中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的mRNA表达比较 见表1。

表1 不同改良Thompson分级患者髓核组织中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的mRNA表达比较

注：与Ⅰ级相比，▲P<0.05；与Ⅱ级相比，*P<0.05；与Ⅲ级相比，#P<0.05。

2.2 不同改良Thompson分级患者髓核组织中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的蛋白表达比较 见表2。

表2 不同改良Thompson分级患者髓核组织中HtrA1及MMP-1、3、7、9、13的蛋白表达比较

注：与Ⅰ级相比，▲P<0.05；与Ⅱ级相比，*P<0.05；与Ⅲ级相比，#P<0.05。

2.3 HtrA1与MMP-1、3、7、9、13表达的相关性 78例椎间盘髓核切除者髓核组织中HtrA1 mRNA与MMP-1、3、13 mRNA表达呈正相关(r2分别为0.1448、0.2406、0.8695，P均<0.01)。

3 讨论

椎间盘退变是一个复杂的过程，其疾病的病理机制归因于组成细胞外基质的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的流失[2]。HtrA1是一种具有热休克蛋白性质的膜丝氨酸蛋白，是第一个被发现的人类的该酶家族成员，最初在肉毒病毒40成纤维细胞中被发现。HtrA1丝氨酸蛋白酶的研究多见于肿瘤方面[6]。也有相关研究[3,7]发现，HtrA1在骨关节炎、类风湿关节炎关节软骨组织中的表达量增加，在骨关节炎中起重要的调控作用。同时，亦有学者发现，HtrA1启动子的单核苷酸多态性与椎间盘退变相关[8]。本研究结果发现，随着改良Thompson分级级数的升高，HtrA1 mRNA、蛋白在椎间盘髓核组织中的表达不断升高，表明HtrA1可能参与椎间盘退变的过程。

椎间盘的退变始于髓核，MMPs等降解酶的表达增加会导致髓核细胞外基质的降解加快[2]。沈正清等[9]发现，MMP-3可作为腰椎间盘退变的重要调节因子，参与退变进程。正常椎间盘标本没有肉芽组织形成，凸出型及韧带下型仅有较少肉芽组织，大多数游离型及经韧带脱出型有肉芽组织，纤维环和髓核中的肉芽组织形成越多，MMP-1、3的表达就越强[10]。本研究结果发现，随着改良Thompson分级级数的升高，MMP-1、3的mRNA、蛋白在椎间盘髓核组织中的表达不断升高。胡峰等[11]发现，椎间盘退变及突出越严重,MMP-7表达越强，说明MMP-7与椎间盘的病理改变有关，MMP-7表达增加导致组织降解增强，从而导致椎间盘退变。亦有研究[12]表明，MMP-9在正常髓核内有一定量的表达，在退变腰椎间盘髓核的表达成倍升高，说明退变髓核组织中MMP-9代谢活跃，与椎间盘退变、突出密切相关。Omlor等[13]发现MMP-13基因表达在椎间盘退变过程中上调。亦有研究[14]发现，退变椎间盘的炎性因子可以上调MMP-13的表达，MMP-13的异常表达可导致椎间盘髓核细胞外基质的过度降解，推测MMP-13在椎间盘退变过程中起着非常关键的作用。本研究结果发现，随着改良Thompson分级级数的升高，MMP-13 mRNA、蛋白在椎间盘髓核组织中的表达不断升高，但不同改良Thompson分级椎间盘髓核组织中MMP-7、9表达比较差异无统计学意义。

有研究[15]发现，骨关节炎模型小鼠关节软骨中增加的HtrA1与MMP-13有关。本研究结果发现，HtrA1 mRNA与MMP-1、3、13 mRNA表达呈正相关。最近有研究表明，HtrA1能降解纤维连接蛋白，纤维连接蛋白的降解物则可增加MMPs的产量[7]。推测HtrA1与MMP-1、3、13可共同作用于椎间盘，引起相应的椎间盘病变。

[1] Pereira DR, Silva-Correia J, Oliveira JM, et al. Hydrogels inacellular and cellular strategies for intervertebral disc regeneration[J]. Tissue Eng Regen Med, 2013,7(2):85-98.

[2] Zhang YG, Sun Z, Zhang Z, et al. Risk factors for lumbarintervertebral disc herniation in Chinese population: a case-controlstudy[J]. Spine(Phila Pa 1976), 2009,34(25):918-922

[3] Zhongyi S, Sai Z, Chao L, et al. Effects of nuclear factor kappa B signaling pathway in human intervertebral disc degeneration[J]. Spine(Phila Pa 1976), 2015,40(4):224-232.

[4] 彭宝淦,施杞.退变椎间盘的组织病理学变化[J].中国中医骨伤科杂志,1996,4(6):52-55.

[5] Vandenbroucke RE, Libert C. Is there new hope for therapeutic matrix metalloproteinase inhibition[J]. Nat Rev Drug Discov, 2014,13(12):904-927.

[6] Lorenzi T, Lorenzi M, Altobelli E, et al. HtrA1 in human urothelial bladder cancer: a secreted protein and a potential novel biomarker[J]. Int J Cancer, 2013,133(11):2650-2661.

[7] Grau S, Peter J, Richards, et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease[J]. J BiolChem, 2006,281(10):6124-6129.

[8] Urano T, CaiF, Shi R, et al. Association of HTRA1 promoter polymorphism with spinal disc degeneration in Japanese women[J]. Bone Miner Metab, 2010,28(2):220-226.

[9] 沈正清，叶君健.MMP-3 在退变腰椎间盘组织中的表达及意义[J].实用骨科杂志，2012,18(11):993-996.

[10] 李先安，吕国华，刘文和，等.基质金属蛋白酶-1、3在椎间盘的表达和意义[J].中国医师杂志,2005,7(6):764-766.

[11] 胡峰，李康华，孙贤德，等.基质金属蛋白酶-7在椎间盘组织中的表达和意义[J].医学临床研究,2006,23(3):311-313.

[12] 赵瑛，谭祖键，吴雪晖，等.基质金属蛋白酶-9在腰椎间盘髓核组织中的表达[J].创伤外科杂志,2007,9(3):261-263.

[13] Omlor GW, Lorenz H, Engelleiter K, et al. Changes in gene expression and protein distribution at different stages of mechanically induced disc degeneration--an in vivo study on the New Zealand white rabbit[J]. J Orthop Res, 2006,24(3):385-392.

[14] Le Maitre CL, Freemont AJ, Hoyland JA. Localization of degradative enzymes and their inhibitors in the degenerate human intervertebral disc[J]. J Pathol, 2004,204(1):47-54.

[15] Holt DW, Henderson ML, Stockdale CE, et al. Osteoarthritis-like changes in the heterozygous sedc mouse associated with the HtrA1-Ddr2-Mmp-13 degradative pathway: a new model of osteoarthritis[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2012,20(5):430-439.

国家自然科学基金资助项目(81601931)；江苏省自然科学基金资助项目(BK20150475)；镇江市重点研发计划-社会发展资助项目(SH2015085)。

黄永辉(E-mail: huangyh8855@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.031

R681.5

B

1002-266X(2017)22-0083-03

2016-11-09)