氧合血体外持续灌注保存对猪供肺移植后功能的影响

黄爱兰，韦慧君，龙小毛，胡彦艳，江晓欢

(1广西壮族自治区人民医院，南宁 530021；2广西医科大学第二附属医院；3玉林市第一人民医院)

氧合血体外持续灌注保存对猪供肺移植后功能的影响

黄爱兰1，韦慧君2，龙小毛1，胡彦艳1，江晓欢3

(1广西壮族自治区人民医院，南宁 530021；2广西医科大学第二附属医院；3玉林市第一人民医院)

目的 观察氧合血体外持续灌注保存对猪供肺移植后功能的影响。方法 将24只广西巴马小型香猪随机分为观察组与对照组各12只，每组供体、受体各6只。手术切除观察组与对照组供体双侧肺，分别经氧合血体外持续灌注保存、低温静态保存各8 h，后将供体左肺分别移植入两组切除左肺的受体。比较两组再灌注0.5、2、4、6 h时左下肺静脉氧合指数(PaO2/FiO2)，HE染色观察两组供肺保存前(T0)、供肺保存8 h(T1)、再灌注3 h(T2)和再灌注6 h(T3)左下肺肺组织病理。结果 观察组再灌注0.5、2、4、6 h时左下肺静脉PaO2/FiO2分别为(482.50±30.72)、(467.17±31.06)、(441.17±17.86)、(422.33±46.45)mmHg，对照组分别为(413.83±18.53)、(389.67±7.28)、(313.67±24.53)、(308.50±50.45)mmHg，观察组再灌注6 h与本组再灌注0.5 h时相比，对照组再灌注4、6 h与本组再灌注0.5 h时相比，两组再灌注各时点相比，P均﹤0.05。两组随再灌注时间延长，肺间质逐渐增宽，肺泡组织结构逐渐塌陷，肺泡水肿逐渐明显，肺泡腔内可见渗出物，且对照组肺组织结构损伤在同一时间点比观察组重，T3时对照组肺组织水肿分级比观察组高(P﹤0.05)。结论 氧合血体外持续灌注保存猪供肺移植后肺氧合功能稳定、组织结构较完整。

肺移植；供体保存；氧合血；体外持续灌注保存；低温静态保存；缺血再灌注损伤；肺功能；动物实验

肺移植是终末期肺疾病患者挽救生命的有效手段[1]。随着肺移植手术技术和围术期管理水平的不断改进，肺移植患者的存活率明显提高[2]，但缺血再灌注损伤仍是导致肺移植患者术后早期出现严重肺功能障碍甚至早期死亡的主要原因[3]。有研究表明减轻肺缺血再灌注损伤与供肺保存效果呈正相关[4]，供肺保存质量是关乎移植后肺功能好坏的一个重要因素[5,6]。目前离体肺保护方式有经典肺保护方法“深低温肺保护液静态保存法”、深低温静态保存结合离体肺体外灌注技术(EVLP)、经肺动脉体外持续灌注氧合血保存并运输离体供肺。目前传统的低温离体肺保护方式仍然存在严重的缺血再灌注损伤，氧合血体外持续灌注保存离体肺是否可减轻这种损伤尚无定论。前期研究[7]已成功建立氧合血体外持续灌注装置模型，但体外评估仍不能完全模拟肺移植后体内复杂的炎症反应和免疫反应[8]，其所得到的体外评估结果并不能完全反映移植后的情况。2015年1月～2016年5月，本实验拟在前期研究的基础上，观察氧合血体外持续灌注保存对猪供肺移植后功能的影响，并与低温静态保存进行比较。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂、仪器 24只健康广西巴马小型香猪(广西大学动物科学研究院提供)，麻醉机(Ohmeda，美国)，多功能监护仪(Dash4000，GE)，i-START手持式血液血气分析仪(广州Biotec)，体外循环机(STOCERT-SCⅡ型，德国)，膜肺(Dideco-901儿童型，德国)，Celsior液(Sigma公司)，白细胞过滤器(H20044758，中国威高高分子制品公司)。

1.2 实验分组及处理 将24只猪随机分为观察组与对照组各12只，每组供体、受体各6只，猪龄2～4月，雌雄不限，体质量11～13 kg。所有动物实验由同一组胸外科医生和麻醉科医生共同完成。

1.2.1 供肺获取 所有供体猪术前禁饮禁食8 h。在麻醉诱导(氯胺酮10 mg/kg、咪达唑仑0.5 mg/kg、阿托品0.05 mg/kg肌注)生效后，仰卧位固定于动物手术台上。开放耳缘静脉，插管前静脉注射咪达唑仑0.1 mg/kg、枸橼酸舒芬太尼注射液0.5 μg/kg，气管插管后连接呼吸机(参数：吸入氧浓度50%，潮气量8～10 mL/kg，频率20～22次/min，呼气末正压通气5 cmH2O)，维持呼气末二氧化碳为35～45 mmHg。同时静脉复合镇静止痛药进行术中维持[舒芬太尼0.6 μg/(kg·h)、丙泊酚5～6 mL/(kg·h)、顺苯磺酸阿曲库铵0.1 mg/(kg·h)]。胸骨正中切口，于主动脉前壁插入内径3 mm灌注管肝素化后放血保存，供体外循环预充用。将左心房切开，经肺总动脉注入冷肺保护液Celsior液60 mL/kg，在保持正常机械通气的条件下，于肺膨胀50%时，钳夹隆突上气管并断离，完整切除气管及双侧肺备供体肺。

1.2.2 供肺保存 对照组将已修剪好的双肺置于4 ℃ Celsior肺保护液中保存，静态保存8 h。观察组供肺氧合血体外持续灌注保存。供体肺取出后用5-0滑线将12 F动脉灌注管固定于左右肺动脉内，将肺置于漏斗状容器中，灌注流出的静脉血通过漏斗引流入回流管道。体外循环预充液由自体血(已使用白细胞过滤器去除白细胞)和林格液组成，预充后红细胞压积>20%，灌注压力15～20 mmHg，膜肺供氧气体配比参照N286%、O28%、CO26%[9]进行调整，血气氧分压保持在80 mmHg，二氧化碳分压保持在35～45 mmHg，36 ℃常温体外持续灌注8 h。

1.2.3 受体左肺切除与肺植入 取受体猪，麻醉方法同供体猪。受体猪取右半卧位，左侧第4/5肋间进胸，肝素化后分别在左肺上、下肺静脉根部、左肺总动脉根部及左总支气管根部上阻断钳，在远端断离切除左肺。将已修整好的两组供体左肺移植入受体猪，吻合顺序如下[10]：吻合供受体左总支气管，用4-0 Prolene线连续吻合膜部，间断缝合软骨部，5-0 Prolene线连续缝合供受体左肺总动脉；4-0 Prolene线连续缝合供受体左肺静脉前庭；吻合完成后开放血管，将6 F的T管置入左肺静脉前庭吻合口内，供抽左肺静脉血查血气用。术后缝合切口，全麻机械通气，密切监测生命体征，保存呼吸道清洁通畅。实验结束后将实验动物按照《关于善待实验动物的指导性意见》进行妥善处理[10]。手术过程实验动物生命体征平稳，全部受体猪在移植肺恢复灌注后均在机械通气辅助下存活至6 h后。

1.3 观察指标 ①比较两组气管吻合时间、肺动脉阻断时间和术中出血量。②分别在再灌注0.5、2、4、6 h取0.5 mL左下肺静脉血行血气分析，比较两组左下肺静脉氧合指数(PaO2/FiO2)。③在供肺保存前(T0)、供肺保存8 h(T1)、再灌注3 h(T2)和再灌注6 h(T3)分别拆除胸部手术切口缝线暴露肺组织，切取0.1 g移植左下肺肺组织留病理，然后5-0 Prolene线缝合肺至不漏气，用10%甲醛固定24 h，石蜡包埋，HE染色观察组织结构。由两位资深病理科医师根据独立、双盲的原则进行病理阅片，观察肺组织结构的变化及肺泡腔、毛细血管的改变。用普通光学显微镜在一张玻片上连续看10个高倍(20×10倍)视野，对每个视野肺水肿面积进行估计，取其平均值。浏览整个切片，根据肺泡腔渗出情况进行肺水肿分级[7]，0级：无渗出；Ⅰ级：散在肺泡腔出现少量水肿液及红细胞；Ⅱ级：肺泡内充满水肿液的单一病灶或大量未充满水肿液的病灶；Ⅲ级：大量充满水肿液或红细胞的肺泡病灶；Ⅳ级：弥漫性肺泡水肿出血，大片出血或实质、血管坏死。

2 结果

2.1 两组气管吻合时间、肺动脉阻断时间、术中出血量比较 两组气管吻合时间、肺动脉阻断时间、术中出血量比较差异无统计学意义，见表1。

表1 两组气管吻合时间、肺动脉阻断时间、术中出血量比较

2.2 两组再灌注不同时点左下肺PaO2/FiO2比较 见表2。

表2 两组再灌注不同时点左下肺PaO2/FiO2比较

注：与对照组比较，aP﹤0.01；与同组再灌注0.5 h时比较，bP﹤0.05。

2.3 两组左下肺组织病理观察结果 猪供肺T0时肺泡结构完整，肺间质无增宽，肺泡腔内无出血，肺组织无水肿。T1时，观察组、对照组肺泡结构基本完整，少部分肺间质稍增宽，肺泡腔内无水肿液。T2时，观察组肺间质均匀增厚，约10%肺组织肺泡腔内有水肿液；对照组肺组织病变较观察组更为明显，10%～20%肺组织肺泡腔内有水肿液。T3时，观察组肺间质进一步增宽，部分肺泡融合，20%～30%肺组织肺泡腔内有水肿液；对照组肺组织病变严重且弥漫，肺泡腔内渗出明显，可见肺泡腔完全闭塞甚至实变，30%～40%肺组织肺泡腔内有明显水肿液。两组肺组织水肿分级见表3。

表3 两组肺组织水肿分级(只)

注：两组T3时肺组织水肿分级比较，P﹤0.05。

3 讨论

肺移植是治疗晚期肺实质及肺血管疾病的惟一有效治疗方法。随着外科移植技术、围术期管理水平和免疫抑制剂的快速发展，临床上对供肺保存质量和时间的要求越来越高，供肺保存质量对肺移植是否成功起着关键性的作用。低温静态保存为传统供肺保存方法，但存在以下不足：①器官缺血使内皮细胞被激活而产生氧化应激反应，形成氧化物最终导致细胞通透性增加；②低温使钠、钾泵失活，导致细胞肿胀；③形成微血栓，阻碍再灌注后血流微循环的恢复；④激活炎症细胞释放IL-1β、IL-8等因子，促发再灌注受体强烈的炎性反应；⑤低温对细胞代谢的抑制，使供体在保存过程中丧失了自我修复能力[12]。

为减轻供体时间依赖性缺血再灌注损伤、延长供体器官保存时间并提高供肺保存质量，学者们在器官保存方面不断创新[13]，提出了体外持续灌注保存供体这一新理念。体外持续灌注氧合血保存克服了低温静态保存缺血、缺氧和低温对供肺造成损伤的不足，避免长时间的冷缺血损伤，恢复了离体肺循环。离体肺体外灌注技术EVLP在2001年第一次使用于临床，并获得良好的肺移植效果，目前在全世界许多肺移植中心得到有效应用[14]。该系统主要用于修复边缘肺、扩大肺源，其灌注液成分复杂，过程中需要呼吸机进行机械通气，目前只能在一些较大的实验室进行操作[15]。作为呼吸器官，肺脏能直接从肺泡内获得氧气。同时，肺组织有两套血液循环系统，分别是功能血管(肺动、静脉)和营养血管(支气管动、静脉)，两者之间有毛细血管网互相吻合。单纯使用氧合血经肺动、静脉体外连续灌注离体供肺，理论上氧合血也会通过毛细血管网维持肺组织和支气管氧供及营养，减轻供肺时间依赖性缺血再灌注损伤。临床上肺缺血再灌注损伤的主要表现为肺水肿及急性呼吸衰竭。肺缺血和再灌注过程必然导致血管内皮损伤，继而肺血管通透性增加，正常的肺血屏障遭到破坏，最终导致血管内渗出增多伴大量蛋白漏出血管外形成肺水肿。肺泡水肿的直接后果是导致肺气体交换功能下降、氧合指数降低[16]。有学者指出，肺水肿的程度与供肺保存质量呈反比[17]。

本研究结果表明随再灌注时间延长，两组移植肺左下肺PaO2/FiO2均逐渐下降，观察组各时点PaO2/FiO2高于对照组。本研究病理结果与文献报道的肺缺血再灌注损伤早期形态改变一致[10]，且同一时间点对照组肺组织结构损伤比观察组重、T3时点对照组肺组织水肿分级比观察组高。说明供肺分别经过不同的保存方法保存后移植入受体，均经历缺血和再灌注损伤的过程，氧合能力均受到影响，但氧合血体外持续灌注保存与低温静态保存相比，前者保护了气血屏障，内皮损伤更轻，能使供肺移植后保持更为稳定的气血交换功能。氧合血体外持续灌注保存在体外灌注期间能带走聚集在肺内的氧自由基、激活的炎性因子和微栓等，对血管内皮细胞起到保护作用。同时，已去除白细胞的氧合血提供器官所需代谢底物，维持了正常的酸碱平衡及渗透压。红细胞能供给供肺所需要的氧气，携带组织内所产生的二氧化碳，改善细胞有氧代谢，保护上皮功能，减少对肺泡表面活性物质的损伤，进而有利于肺移植手术。

综上可见，氧合血体外持续灌注保存猪供肺移植后肺氧合功能稳定、组织结构较完整。但本实验样本量少且观察时间较短，后期需进一步证实。

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Effect of ex vivo oxygenated blood continuous perfusion on pulmonary function in pigs after lung transplantation

HUANGAilan1,WEIHuijun,LONGXiaomao,HUYanyan,JIANGXiaohuan

(1ThePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To observe the effect of ex vivo oxygenated blood continuous perfusion on lung function in pigs after lung transplantation.Methods Twenty-four Guangxi miniature pigs were randomly divided into the observation group and the control group, and each group had 6 donors and 6 receptors. After being completely resected, bilateral lungs of the donors were preserved by ex vivo oxygenated blood continuous perfusion and static cold storage for eight hours, respectively, and then the left lungs were transplanted into the receptors. We compared the PaO2/FiO2of the left lower pulmonary vein between the observation group and the control group at 0.5, 2, 4, 6 h after reperfusion. Using HE staining to observe the pulmonary tissues, which were collected at the time of before preserving (T0), after eight hours saved (T1), three (T2) and six (T3) hours after reperfusion.Results The PaO2/FiO2of the left lower pulmonary vein were (482.50±30.72), (467.17±31.06), (441.17±17.86), and (422.33±46.45) mmHg in the observation group, versus (413.83±18.53), (389.67±7.28), (313.67±24.53), and (308.50±50.45) mmHg in the control group, at 0.5, 2, 4, 6 h after reperfusion, respectively. There were significant differences between 6 h and 0.5 h in observation group, between 4 h, 6 h and 0.5 h in the control group as well as between these two groups at each time point (allP<0.05). Pathological examination showed that, as the time went by, alveolar interval became wider gradually, alveolar structure gradually collapsed, alveolar edema got obvious, and exudation was seen in the alveolar cavity. The organization structure of pulmonary tissue in the control group changed worse than that in the observation group, and the pulmonary edema grading of the control group was higher than that of the observation group at T3(P<0.05).Conclusion The donor lungs after being protected with ex vivo oxygenated blood continuous perfusion can obtain a better oxygenation and maintain a relatively complete structure of lung tissues.

lung transplantation; donor preservation; oxygenated blood; ex vivo continuous lung perfusion storage; cold static storage; ischemia-reperfusion injury; lung function; animal experiment

国家自然科学基金资助项目(81360020)。

黄爱兰(1967 -)，女，硕士，主任医师，主要从事体外循环血液保护的研究。E-mail: 1724835526@qq.com

韦慧君(1990-)，女，硕士，住院医师，主要从事体外循环血液保护的研究。E-mail: 469645078@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.002

R617

A

1002-266X(2017)22-0005-04

2017-04-23)