两种分子检测技术快速诊断肺外结核的研究

郗志华

(太原市第四人民医院，山西 太原 030053)

两种分子检测技术快速诊断肺外结核的研究

郗志华

(太原市第四人民医院，山西 太原 030053)

目的：探讨GeneXpert MTB/RIF技术与结核分枝杆菌实时荧光定量聚合酶链反应(TB-PCR)在肺外结核诊断中的价值。方法：回顾性分析33例确诊的肺外结核病患者，比较结核分枝杆菌实时荧光定量聚合酶链反应(TB-PCR)、GeneXpert MTB/RIF技术的阳性率。结果：涂阳培阳时，GeneXpert MTB/RIF技术阳性率100%，TB-PCR 100%，差异无统计学意义(P>0.05);涂阴培阳时，GeneXpert MTB/RIF技术阳性率100%，TB-PCR 91.3%，差异无统计学意义(P>0.05);涂阳培阴时，GeneXpert MTB/RIF技术阳性率100%，TB-PCR 66.7%，差异无统计学意义(P>0.05)。结论：GeneXpert MTB/RIF技术及TB-PCR在肺外结核诊断中有重要价值。

GeneXpert MTB/RIF技术；TB-PCR；肺外结核

被称为“白色瘟疫”的结核病是伴随人类历史最长的疾病之一 ，也是由单一致病菌引起死亡最多的疾病。通过空气传播进入肺部，再通过血流进入身体其他部位。即造成肺结核和肺外结核。随着人流量增大、结核耐药菌的出现、一些排菌患者管理不善，结核有死灰复燃之势。肺外结核在结核中大约有20%。肺外结核临床表现多样，症状不典型，部分标本留取不便，菌量少等特点，比肺结核诊断困难。如何快速，有效诊断肺外结核迫在眉睫。近年来分子诊断技术飞速发展，GeneXpert 结核分枝杆菌(MTB)/利福平(RIF)检测技术以全自动半巢式实时PCR技术为基础 ，受到世界广泛关注。在我国GeneXpert MTB/RIF技术用于肺外结核诊断少有报到。本研究将33例确诊的肺外结核患者的体液同时进行GeneXpert MTB/RIF和结核分枝杆菌实时荧光定量聚合酶链反应(TB-PCR)检测对比分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年8月～2016年9月于太原市第四人民医院通过体液培养，涂片确诊肺外结核病患者33例，男16例，女17例，年龄14～82岁，平均(43.2±3.6)岁。体液样本有胸水，腹水，脑脊液，尿液，脓。同时进行涂片，培养，GeneXpert MTB/RIF和TB-PCR检测。

1.2 试剂与仪器

二级生物安全柜(海尔)，抗酸染液、BACTEC MGITBD960液体快速培养(美国BD公司)，实时荧光定量PCR试剂及仪器(中山达安股份有限公司)，全球基金项目配备的GeneXpert 检测仪及试剂。

1.3 方法

1.3.1 涂片抗酸染色 竹签挑取脓(胸水或腹水、脑脊液、尿液离心留取沉淀)，在玻片2/3处涂，面积为1 cm×2 cm，在二级生物安全柜(海尔)紫外线照射0.5h，行抗酸染色，镜检。参照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[1]。

1.3.2 BACTEC MGITBD960液体快速培养 吸取适量体液，加入2倍的2%枸橼酸钠半胱氨酸一氢氧化钠(2%NALC-NaOH)前处理液，旋窝震荡 20s。室温静置 15～20 min，不能超过 20 min。加无菌磷酸盐缓冲液 PBS(pH6.8)至约 40 mL，盖紧盖子，3 000 r离心 15 min，倒掉上清液。添加 1～3 mL PBS(pH6.8)以中和 pH 至 6.8。取处理后标本 0.5 mL加入准备好的 MGIT 培养管培养，按《分枝杆菌分离培养标准化程序及质量保证手册》[2]要求。当培养阳性时，涂片确认。

1.3.3 TB-PCR 采用中山大学达安基因股份有限公司提供的结核分枝杆菌核酸检测试剂(PCR-荧光法)，对体液中结核分枝杆菌DNA进行分析；严格按操作说明。

1.3.4 GeneXpert 技术 用美国Cephid公司提供的消化液消化1mL体液15min，消化液量视情况而定。吸取2mL消化后的液体加入试剂盒。把试剂盒放入检测仪中，编号登记。经1.5h，由电脑软件自动读取结果，可以同时检测出结核分支杆菌的量及利福平耐药性。

1.4 统计学方法

应用SPSS18.0统计学软件进行数据分析。计数资料以率(%)表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

涂阳培阳时，GeneXpert MTB/RIF技术阳性率100%，TB-PCR 100%，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1；涂阴培阳时，GeneXpert MTB/RIF技术阳性率100%，TB-PCR 91.3%，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2；涂阳培阴时，GeneXpert MTB/RIF技术阳性率100%，TB-PCR 66.7%，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表1 涂阳培阳GeneXpert MTB/RIF与TB-PCR比较

表2 涂阴培阳GeneXpert MTB/RIF与TB-PCR比较

表3 涂阳培阴GeneXpert MTB/RIF与TB-PCR比较

3 讨论

肺外结核临床表现多样，症状不典型，经验诊断不统一，使一部分患者误诊漏诊。本文收集的是病原学确诊患者，由于胸腹水、尿液量大，脑脊液标本量少，脓粘稠不易分解等特点，入选病例少。传统的涂片阳性率低，培养周期长，阳性率也不高，不能满足临床需要。

GeneXpert MTB/RIF 是由美国Cepheid公司研发、采用一种半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术,实现自动化。它可以自动完成样品的制备，核酸的提取、扩增，目标序列的检测等。其步骤在独立的一次性试剂盒内由系统自动完成，检出时间只需1.5 h左右。 GeneXpert检测试剂盒能检测样本中的结核分支杆菌和与利福平耐药相关的rpoB基因,主要针对rpoB 基因的81bp中部分区域设计探针，能对耐多药患者进行初筛。该技术生物安全性高，简单快速，避免交叉污染。本研究回顾分析应用GeneXpert MTB/RIF 系统检测确诊肺外结核患者的体液，其阳性率明显高于张爱梅等[3]的报道，可能是标本量少，没有分类。GeneXpert MTB/RIF与金标准一致符合李妍等[4]的报道。

荧光定量TB-PCR是体外扩增检测结核分枝杆菌DNA，但是报道的阳性率差异很大。TB-PCR法存在假阳性与假阴性等问题。出现假阴性的原因可能是体液中菌量少，手工操作多损失部分，一些标本不均匀(没取到菌)。出现假阳性的原因可能是操作过程有污染。

综上所述，GeneXpert技术操作简单，高效，快速，生物安全性高，但试剂昂贵，TB-PCR法存在假阳性与假阴性等问题。临床可以根据实际情况选择检测方法。

[1] 中国疾病预防控制中心. 痰涂片镜检质量保证手册[M].北京:中国协和医科大学出版社, 2004.

[2] 赵雁林，王黎霞，成时明，等.分枝杆菌分离培养标准化程序及质量保证手册[M].北京：人民卫生出版社，2013.

[3] 张爱梅，李 锋，刘旭晖，等.结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测在肺外结核中的诊断价值[J].中华传染病杂志，2016，34(3)：174-179.

[4] 李 妍，张天华，鲜小萍，等.Xpert MTB/RIF检测技术诊断肺结核和肺外结核的价值[J].中国防痨杂志，2016，37(6)：586-589.

本文编辑：王知平

郗志华，男，检验师，从事临床检验工作

R446.6

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1671-0126(2017)03-0034-02