血浆miR-1、miR-133a以及miR-126—急性心肌梗死的新型生物学标记物

李翠如，赵春霞

(1.洛阳市第一人民医院，河南 洛阳 471002；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030)

·临床医学·

血浆miR-1、miR-133a以及miR-126—急性心肌梗死的新型生物学标记物

李翠如1，赵春霞2

(1.洛阳市第一人民医院，河南 洛阳 471002；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030)

目的：探讨急性心肌梗死(AMI)早期血浆miR-1、miR-133a以及miR-126的水平变化，与血浆cTnI的相关性，及三者是否可作为早期诊断AMI标记物。方法：应用real-time PCR方法，检测24位AMI患者以及8名对照者血浆miR-1、miR-133a以及miR-126的含量，运用ELISA方法检测血浆肌钙蛋白I(cTnI)浓度。ROC曲线分析上述三种血浆miRNAs在AMI中的诊断价值及意义，并分别与cTnI相对比。结果：三种循环miRNAs在AMI患者中均存在显著差异性表达，其中AMI患者血浆miR-1的含量较对照组增高约46.6±11.9倍(P=0.001)，血浆miR-133a的浓度较对照组增高39.9±9.5倍(P<0.05)。AMI患者血浆miR-126的水平较对照组显著降低,约为对照组的0.11±0.01倍(P<0.05)。关联性分析表明血浆miR-1以及miR-133a的含量与cTnI呈显著正相关；ROC曲线分析发现，三者均有显著的诊断价值，其中以低表达的miR-126诊断效力最强(AUC：1.000，95%可信区间为0.000～1.000)。联合miR-1和miR-133a显著提高二者的诊断效能(AUC：0.964，95%可信区间为0.000～1.000)。结论：AMI早期血浆miR-1、miR-133a以及miR-126水平变化显著，与血浆cTnI相关性好，可作为早期诊断AMI标记物，具有临床应用前景。

急性心肌梗死；miRNAs；生物学标记物

急性心肌梗死(AMI)，具有较高的患病率及致死率，是严重危害人类健康的心血管急危重症之一。早期正确地识别和诊断AMI对于提高患者生存率，改善患者预后极为重要。肌钙蛋白因具有较好的特异性和灵敏度，一直以来都被用作诊断AMI最为重要的生物学标记物，但是在一些非AMI的情况下，如慢性肾病、感染性休克、脓毒血症等，其含量亦会升高，这无疑对早期诊断AMI造成困扰。因此需要寻求一些新的有效的生物学标记物，以便更加准确地对AMI做出判断。

MicroRNAs(miRNAs)是一种内生性、小分子、非编码RNAs，成熟的miRNAs仅由21-25个碱基组成，不具备蛋白翻译功能，其主要的生物学作用是在细胞浆内通过与靶信使RNAs的3′端非编码区(3′UTR)序列完全或不完全互补结合，促进靶信使RNAs的降解或抑制其蛋白的翻译，从而在转录后水平调控基因的表达。研究发现机体内约1/3的编码基因接受miRNAs的调控。随着研究的深入，越来越多的miRNAs被证实在多种生理和病理过程中扮演着极为重要的角色。2008年研究者们在血浆中发现了循环miRNAs(或血浆miRNAs)的存在，随后研究表明，循环miRNAs具有极强的稳定性，其通过与囊泡、HDL以及RNA相关结合蛋白结合，能有效地逃避血浆中高活性的RNase酶的降解[1]。因而稳定存在于血浆中的循环miRNAs被广泛证实可以作为诊断和鉴别疾病的重要生物学标记物[2]。近年来，血浆miRNAs亦逐步被发现可成为诊断各类心血管疾病重要的生物学标记物。如血浆miR-423-5p可能是诊断心力衰竭极强的预测因子；循环miR-208和miR-499则可作为心肌损伤疾病(病毒性心肌炎)的生物标记物。miR-1以及miR-133a是心肌来源的miRNAs，而miR-126则来源于内皮细胞，前期研究表明上述三种miRNAs与心肌损伤密切相关，那么它们是否可以成为诊断AMI的生物标记物？其诊断价值如何？目前仍不清楚。为探讨该问题，本研究检测了AMI患者血浆miR-1，miR-133a以及miR-126的含量，并将其与对照人群相比较，从而探讨血浆miR-1、 miR-133以及miR-126作为诊断AMI生物学标记物的可能性，明确上述循环miRNAs对AMI的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究人群

24位急性心肌梗死患者及8位非冠心病(冠脉造影证实)的胸痛患者被纳入本研究。全部急性心肌梗死患者均是于2015年在华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科救治，在征得患者及家属知情同意后留取5ml新鲜血液标本于EDTA抗凝管中，经低温离心后，留取上层血浆置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 血浆RNAs提取、逆转录及Real-time PCR检测

运用TRIzol LS Reagent(Invitrogen)提取血浆总RNAs，每250 mL新鲜血浆加入750 mL TRIzol LS，充分震荡混匀后，采用酚-氯仿抽提法抽提血浆RNAs。运用逆转录试剂盒(Transcript First-strand cDNA synthesis SuperMix北京全式金生物技术有限公司)逆转录血浆miR-1以及miR-133a；逆转录引物(The Bulge-LoopTMmiRNA RT primer)购于广州锐博生物科技有限公司。SYBR Green PCR SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)用于检测血浆miR-1以及miR-133a的含量，以血浆U6作为内对照。

1.3 血浆肌钙蛋白I(cTnI)检测

运用Human Troponin I ELISA试剂盒(台湾亚诺法生技股份有限公司)检测AMI患者及对照人群血浆cTnI含量，具体步骤见试剂盒使用说明书。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 血浆miR-133a、miR-1及miR-126的水平

表1为所有研究者的基本临床资料。两组人群在性别，年龄，吸烟，饮酒，以及罹患高血压、糖尿病上均无统计学差异(P>0.05)，具有较强的可比性。图1结果提示血浆miR-1(A)及miR-133a(B)的含量在AMI患者明显升高，分别较对照组升高约47倍和40倍。而令人感兴趣的是，血浆miR-126(C)的水平在心梗患者较正常对照组显著降低(下降约10倍)。与此同时，还检测了传统AMI标记物：cTnI的血浆含量，AMI患者 为(7.47±2.59 ng/mL)较对照组(0.015±0.003 ng/mL)显著升高(P<0.01)(图2)。

表1 AMI患者及对照者基本临床资料

图1 AMI患者血浆miR-1(A)、miR-133a(B)及miR-126(C)的表达水平； **P<0.01

Fig1 The Expressions of Plasma miR-1, miR-133a, and miR-126 of AMI PatientsP<0.01

图2 AMI患者血浆肌钙蛋白I(cTnI)的含量；**P<0.01

2.2 血浆miR-1及miR-133a与cTnI的相关性

本研究分别将上述三种miRNAs与cTnI进行了关联性分析，结果如图3所示：血浆miR-1(A)以及miR-133a(B)与cTnI存在显著正相关，其相关性系数r分别为0.397和0.394，而血浆miR-126含量与cTnI无明显相关性；这一结果可能提示：血浆miR-1、miR-133a与cTnI可能均由受损坏死心肌细胞释放而来，而内皮源性的miR-126则不受坏死心肌细胞的影响。

图3 急性心肌梗死患者血浆miR-1(A)、miR-133a(B)与cTnI的相关性；

Fig3 The Correlation of Plasma Levels of miR-1(A) and miR-133a (B) of AMI Patients with Plasma cTnI

2.3 血浆miR-1，miR-133a以及miR-126对于AMI的诊断价值

通过ROC曲线分析，可明确血浆中差异性表达的miR-1，miR-133a以及miR-126对诊断AMI的意义。在AMI患者中，血浆miR-1，miR-133a以及miR-126均表现出极强的诊断价值，它们的ROC曲线下面积(AUC)分别是0.938(95%可信区间为0.000～1.000)、0.875(95%可信区间为0.755～0.995)以及1.000(95%可信区间为0.000～1.000)(图4)。这一结果表明血浆miR-1，miR-133a以及miR-126均具有较强的诊断AMI的能力，其中以血浆miR-126的诊断效能最强，其诊断能力与传统AMI标记物cTnI近似。此外，还发现尽管升高的血浆miR-133a和miR-1 与cTnI(AUC:1.000，95%可信区间0.000～1.000)相比没有表现出更强的诊断价值，但将miR-1和miR-133a视作整体进行评估，能够极大的提高其诊断价值(表2)， ROC曲线下面积为0.964(95%可信区间为0.000～1.000)。

图4 血浆miR-1、miR-133a以及miR-126在心肌梗死中的诊断价值；ROC Curve (receiver operator characteristic curve)：ROC 曲线

表2 血浆miR-1，miR-133a以及miR-126诊断心肌梗塞的ROC曲线下面积

AUC：ROC曲线下面积；cTnI：心肌肌钙蛋白I; MiR-1+MiR-133a：miR-1联合miR-133a;

3 讨论

miRNAs的组织特异性、血浆稳定性以及其在疾病状态下的差异性促成了其成为疾病新的生物学标记物的可能。大量的研究表明循环miRNAs可成为多种疾病的生物标记物[3]。随后在心血管领域，越来越多的血浆miRNAs被证实可以成为包括心力衰竭、冠心病、高血压在内的多种心血管疾病的潜在生物学标记物。其中，最受关注的仍然是AMI。AMI是以突发的心肌细胞坏死为特征，常伴随着一些心肌细胞内容物的释放，这其中包括心肌特异性的miRNAs。在AMI时，心肌来源的miR-208及miR-499将大量释放入血，从而使其血浆含量显著升高，具有较强的诊断价值。除此之外，一些非心肌特异性的miRNAs，如miR-21、miR-361-5p、miR-30、miR-195、let-7b等在AMI患者血浆中也存在显著的差异性表达[4]，因此非心肌源性的血浆miRNAs也可能具有诊断AMI的能力。

miR-133a和miR-1均是心肌细胞含量丰富的miRNAs。前期的研究发现，血浆miR-133a与AMI密切相关；在早期的研究中，研究人员对比了急性冠脉综合征(ACS)患者体循环与冠脉循环中miRNAs的表达谱，研究发现ACS患者冠脉循环中miR-133a的含量较体循环明显增高，这一有趣的结果可能提示：在心肌损伤时，受损细胞内的miR-133a将从损伤心肌大量释放入冠脉循环中，并最终入血液循环。另一项研究发现，钙离子可刺激细胞分泌外泌体，从而释放miR-133a。此外，有研究还发现血浆miR-133a含量与冠心病患者冠脉狭窄程度呈正相关，在一定程度上，miR-133a对于诊断隐匿性的冠心病优于cTnI[5]。动物实验研究提示血浆miR-1与AMI相关，研究表明血浆miR-1水平在AMI时显著升高，6小时即达到高峰，其浓度与模型动物心梗面积呈正相关。MiR-126是内皮来源的miRNAs，早期研究表明，血浆miR-126水平在冠心病患者中显著降低。同时其含量在心衰患者中也存在差异性表达，其水平与心衰患者的年龄以及NYHA分级呈负相关。

本研究选择了miR-1，miR-133a以及miR-126作为主要的研究对象，同时以非心源性胸痛的患者作为对照，探讨3种循环miRNAs在AMI时的含量变化，及其对AMI的诊断价值。结果提示血浆miR-1及miR-133a的水平在AMI患者显著增高，而血浆miR-126的含量则显著降低。此外，本研究发现AMI患者增高的血浆miR-1以及miR-133a含量与cTnI浓度呈正相关。ROC曲线分析发现三者均有极强的诊断价值。其中以血浆miR-126的诊断效能最强，与传统心梗标记物cTnI相近似。更有趣的是，将miR-1和miR-133a作为整体评估，能更进一步提升其诊断AMI的能力。因此，三者均可能成为诊断AMI新的潜在生物学标记物。

近年来，随着研究的深入，研究者们对循环miRNAs有更多的期待。循环miRNAs不仅能提高疾病诊断的准确度和精度，还被发现可用于评估疾病发生不良事件的风险及预后[6]。同时，循环miRNAs被证实是具有生物学功能的小分子，它们在细胞-细胞间的信息交流传递中也发挥着重要作用[7]。因此，更多的更深入的研究有待进一步的展开。

[1] Wang F, Chen C, Wang D. Circulating MicroRNAs in Cardiovascular Diseases: from biomarkers to therapeutic targets[J]. Front Med,2014(8): 404-418.

[2] Alipoor SD, Adcock IM, Garssen J, et al. The Roles of MiRNAs as Potential Biomarkers in Lung Diseases[J]. Eur J Pharmacol,2016,791: 395-404.

[3] Guo Z, Zhao C, Wang Z. MicroRNAs as Ideal Biomarkers for the Diagnosis of Lung Cancer[J]. Tumour Biol,2014,35: 10395-10407.

[4] Wang F, Long G, Zhao C, et al. Atherosclerosis-Related Circulating miRNAs as Novel and Sensitive Predictors for Acute Myocardial Infarction[J]. PLoS One,2014(9): 105734.

[5] Wang F, Long G, Zhao C, et al. Plasma microRNA-133a is a New Marker for Both Acute Myocardial Infarction and Underlying Coronary Artery Stenosis[J]. J Transl Med,2013(11): 222.

[6] Zampetaki A, Willeit P, Tilling L, et al. Prospective Study on Circulating MicroRNAs and Risk of Myocardial inFarction[J]. J Am Coll Cardiol,2012,60: 290-299.

[7] Hergenreider E, Heydt S, Treguer K, et al. Atheroprotective Communication between Endothelial Cells and Smooth Muscle Cells through MiRNAs[J]. Nat Cell Biol,2012,14: 249-256.

本文编辑：王知平

Plasma miR-1, miR-133a, and miR-126 as Novel Biomarkers of Acute Myocardial Infarction

LI Cuiru1，ZHAO Chunxia2

(1.TheFirstPeople'sHospitalofLuoyangCity，Luoyang471002，Henan,China；2.TongjiHospitalAffiliatedTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,Hubei,China)

Objective: To study the changes of miR-1, miR-133a, and miR-126 in the early acute myocardial infarction patients, the correlation of the three of them with plasma cardiac troponin I (cTnI), and powerful biomarkers for the early diagnosis of acute myocardial infarction.Methods:Total 24 patients with acute myocardial infarction (AMI) were recruited in this study. The expressions of circulating miR-1, miR-133a, and miR-126 were detected in 24 AMI patients and 8 healthy people as control group by real-time PCR. Plasma cardiac troponin I (cTnI) concentrations were measured by ELISA. The receiver operating characteristic (ROC) curve was used to assess the diagnostic value of these three circulating miRNAs for diagnosing AMI.Results:According to the study, there was significantly differential expression observed in these three miRNAs，in which the expressions of miR-1 (46.6±11.9 fold)(P=0.001) and miR-133a (39.9±9.5 fold)(P<0.05) were remarkably increased in AMI patients, whereas the concentration of miR-126 (0.11±0.01 fold)(P<0.05) was reduced. The correlation analysis showed that plasma levels of miR-1 and miR-133a were positively correlated with plasma cTnI. ROC analysis revealed that all of these three circulating miRNAs had significant diagnostic value. Among Which, the diagnostic power of miR-126 was the strongest (AUC: 1.000, 95% confidence interval 0.000-1.000). The combination of miR-1 and miR-133a significantly improved the diagnostic accuracy (AUC: 0.964, 95% confidence interval 0.000-1.000).Conclusions:Circulating miR-1, miR-133a, and miR-126, the correlation of which with plasma cardiac troponin I (cTnI)has been proved, can be potential and powerful biomarkers for early diagnosis of acute myocardial infarction.

acute myocardial infarction; miRNAs; biomarker.

国家高技术研究发展计划(2014AA022304)

李翠如，女，主管检验师，从事检验临床工作

R446.11

A

1671-0126(2017)03-0004-05