肝再生磷酸酶-3上调转化生长因子-beta促进结肠癌LoVo细胞侵袭的机制研究

施景龙 罗兴喜 许鹤洋 蓝球生 黄永亮 褚忠华*

肝再生磷酸酶-3上调转化生长因子-beta促进结肠癌LoVo细胞侵袭的机制研究

施景龙1罗兴喜2许鹤洋2蓝球生2黄永亮2褚忠华2*

目的探讨转化生长因子-beta（TGF⁃beta）通路在肝再生磷酸酶⁃3（PRL⁃3）促进结肠癌细胞侵袭和转移中的作用机制。方法酶联免疫吸附试验ELISA检测实验组与对照组结肠癌细胞TGF⁃beta水平表达差异，Transwell侵袭小室法检测LoVo细胞侵袭能力变化，Western blot检测相关通路蛋白水平变化。结果ELISA实验检测结肠癌细胞转染PRL⁃3后，稳定表达PRL⁃3的LoVo细胞（LoVo⁃P）与对照组（LoVo⁃C）相比，TGF⁃beta表达明显升高（114±11 pg/mL比56±8 pg/ mL，P＜0.01）。Transwell侵袭实验提示不同浓度的TGF⁃beta中和抗体（1、10、100 ng/mL）作用LoVo⁃P后其侵袭能力逐渐降低，对照组穿膜细胞数为142.7±11.3个，实验组分别为96.1±8.2、67.3±9.4、48.6±6.4个（P＜0.05）。蛋白印记实验提示PI3K/AKT信号通路参与了其诱导侵袭的过程，使用PI3K抑制剂LY294002（10 mg/mL）后，LoVo⁃P的AKT磷酸化蛋白的表达水平降低2.5倍（P＜0.05）。结论PRL⁃3能诱导结肠癌LoVo细胞分泌TGF⁃beta，激活PI3K/AKT信号通路进而促进结肠癌LoVo细胞侵袭。

肝再生磷酸酶-3；结肠癌；转化生长因子-beta；侵袭

结直肠癌是我国常见恶性肿瘤之一，多数病人常常由于肝转移而死亡。前期研究表明肝再生磷酸酶-3（phosphatase of regenerating liver⁃3，PRL⁃3）的表达与结肠癌的TNM分期呈正相关，提示其参与了结肠癌肝转移的过程［1］，然而其具体机制尚不清楚，我们前期细胞因子芯片结果初步提示PRL⁃3能够上调TGF⁃beta表达。本研究拟通过已构建稳定表达PRL⁃3结肠癌细胞株，检测TGF⁃beta细胞因子在PRL⁃3诱导结肠癌细胞侵袭中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

稳定转染PAcGFP⁃PRL⁃3的人结肠癌LoVo细胞由中山大学孙逸仙纪念医院医研中心保种；细胞培养基RPMI 1640，胰蛋白酶和胎牛血清购自Gibco公司；酶联免疫吸附试验（ELISA）、筛选抗生素G418、PI3K抑制剂（LY294002）购自Sigma公司；人TGF⁃beta中和抗体购自R&D Systems公司；TGF⁃beta抗体、兔抗人总AKT（T⁃AKT）和p⁃AKT抗体购自美国CST公司；蛋白裂解液，蛋白酶抑制剂（PMSF）及凝胶配制试剂盒均购自碧云天生物公司；细胞培养瓶及相关培养耗材购自美国Corning公司。

1.2 细胞培养

复苏的结肠癌LoVo⁃P、LoVo⁃C细胞用含10%胎牛血清及100mg/mLG418的1640培养液培养，用含10%胎牛血清的1640培养液培养，置于37℃、5%CO2培养箱中，待细胞长达80%，用胰酶消化传代。

1.3 ELISA检测

严格按照试剂盒说明书操作，采用双抗体夹心法，1×106LoVo⁃P、LoVo⁃C/孔种于六孔板，培养24 h后，收集细胞上清：2～8℃1000×g离心15min取上清，上清立即用于实验。

1.4 Western blot法

将培养后的LoVo细胞加入1%PMSF的蛋白裂解液处理，提取细胞中的总蛋白并定量，取蛋白样品40μg，加入5×上样缓冲液，98℃沸水煮5min后上样。经过十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶（PAGE）电泳后，将蛋白恒流200mA 2 h转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜置于5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1 h后与特异性一抗，GAPDH，4℃孵育过夜。次日用TBST液每次10 min洗膜3次，加入相应的二抗室温孵育1 h，用增强ECL发光试剂盒检测信号强度。

1.5 侵袭实验

细胞侵袭实验室用24孔Transwell小室（8.0-μm）。用无血清培养基以1∶5稀释基质胶Matrigel，以40μL/孔均匀涂至Transwell小室上表面。将细胞用无血清培养基出处理24 h后，用无血清培养基调整细胞浓度为5×104/mL，将200μL的各组细胞悬液加入到上室中，同时下室加入500μL的含有10%FBS的RPMI⁃1640培养基，培养24 h后，甲醛固定，结晶紫染色。在显微镜下随机选取5个高倍镜视野记数穿膜的细胞数目。

1.6 统计学方法

应用SPSS 15.0统计软件分析，两两比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，结果采用均数±标准差（表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PRL⁃3能诱导结肠癌LoVo细胞分泌TGF⁃beta

稳定转染PRL⁃3后，分别收集LoVo⁃P细胞和LoVo⁃C细胞培养上清，通过ELISA检测后发现，LoVo⁃P细胞培养上清中TGF⁃beta的蛋白水平明显较LoVo⁃C上清高114±11 pg/mL比56±8 pg/mL（P＜0.01）（图1）。

图1 PRL⁃3对LoVo细胞TGF⁃beta蛋白分泌的影响

2.2 中和TGF⁃beta对LoVo⁃P细胞侵袭性的影响

在LoVo⁃P细胞培养基中加入不同浓度的TGF⁃beta细胞因子中和抗体（1、10、100 ng/mL）后培养24 h后，IgG为对照组，Lovo⁃P的侵袭能力移得到抑制，对照组穿膜细胞数为（142.7±11.3）个，实验组（1、10、100 ng/mL）穿膜细胞数分别为96.1±8.2、67.3±9.4、48.6±6.4个，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。结果提示，中和TGF⁃beta可以显著抑制PRL⁃3诱导LoVo细胞的侵袭能力。

图2 中和TGF⁃beta对LoVo⁃P细胞侵袭性的影响

2.3 TGF⁃beta上调PI3K/AKT信号通路促进结肠癌LoVo细胞侵袭

转染后通过蛋白印迹实验提示PRL⁃3能够激活PI3K/AKT信号通路。TGF⁃beta细胞因子（10 ng/ mL）刺激LoVo⁃C后，LoVo⁃C的AKT磷酸化蛋白的表达水平升高3.2倍；使用PI3K抑制剂（LY294002）（10mg/mL）后，LoVo⁃P的AKT磷酸化蛋白的表达水平降低2.5倍，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图3）

图3 TGF⁃beta/PI3K/AKT通路对结肠癌LoVo细胞侵袭的调控

3 讨论

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，肝转移是其导致病人死亡的主要原因。我们前期研究发现，PRL⁃3的表达和结直肠癌的TNM分期呈正相关，提示其参与了结直肠癌肝转移的过程［2］。文献复习表明肿瘤炎症微环境能够促进肿瘤的侵袭和转移［3，4］。我们后续的研究发现，PRL⁃3蛋白能够诱导肿瘤相关性巨噬细胞TAM的浸润，从而促进结肠癌的侵袭和转移，提示PRL⁃3能够调控结直肠癌细胞炎症微环境导致结肠癌肝转移的发生［5］。本研究通过ELISA结果分析发现，稳定转染PLR⁃3的LoVo细胞能够上调细胞因子TGF⁃beta的表达，通过使用TGF⁃beta中和抗体，可以显著抑制PRL⁃3蛋白诱导的结肠癌细胞侵袭和转移过程，提示TGF⁃beta可能是PRL⁃3的下游信号分子发挥其生物学效应。

研究表明TGF⁃beta主要通过Smads信号通路和非Smads信号通路广泛参与细胞免疫、增殖、生长和分化的过程［6］。研究进一步证实TGF⁃beta能够通过Smad3诱导Snail表达抑制E⁃cadherin表达以及Wnt信号通路参与了肿瘤细胞上皮间质化的过程［7，8］。我们后续研究证实TGF⁃beta所介导的PI3K/AKT信号通路参与了PRL⁃3诱导结肠癌侵袭的过程，为结肠癌肝转移的治疗提供了潜在的治疗靶点。

［1］Peng L，Xing X，Li W，et al.PRL⁃3 promotes the motility，invasion，andmetastasisof LoVo colon cancer cells through PRL⁃3⁃integrin beta1⁃ERK1/2 and⁃MMP2 signaling［J］.Mol Cancer，2009，8：110.

［2］Bardelli A，Saha S，Sager JA，et al.PRL⁃3 expression in metastatic cancers［J］.Clin Cancer Res，2003，9（15）：5607-5615.

［3］黄汉源，许鹤洋，来伟，等.肝再生磷酸酶-3诱导肿瘤相关性巨噬细胞分泌白细胞介素-6促进结肠癌细胞转移［J］.中华实验外科杂志，2014，31（7）：1508-1510.

［4］Nasser MW，Elbaz M，Ahirwar DK，Ganju RK.Conditioning solid tumormicroenvironment through inflammatory chemokines and S100 family proteins［J］.Cancer Lett，2015，365（1）：11-22.

［5］Xu H，LaiW，Zhang Y，et al.Tumor⁃associated macrophage⁃derived IL⁃6 and IL⁃8 enhance invasive activity of LoVo cells induced by PRL⁃3 in a KCNN4 channel⁃dependentmanner［J］. BMCCancer，2014，14（1）：330.

［6］Derynck R，Muthusamy BP，Saeteurn KY.Signaling pathway cooperation in TGF⁃β⁃induced epithelial⁃mesenchymal transition［J］.Curr Opin Cell Biol，2014，31：56-66.

［7］Smith AP，Verrecchia A，Faga G，et al.A positive role for Myc in TGF Signaling pathway cooperation in TGF⁃β⁃induced Snail transcription and epithelial⁃to⁃mesenchymal transition［J］. Oncogene，2009，28（3）：422-430.

［8］Lee SJ，Yang CS，Kim DD，et al.Microenvironmental interactions and expression ofmolecularmarkers associated with epithelial⁃to⁃mesenchymal transition in colorectal carcinoma［J］.Int JClin Exp Pathol，2015，8（11）：14270-14282.

Phosphatase of regenerating liver⁃3 prom oted the invasion of LoVo cells through TGF⁃beta

SHIJinglong1，LUO Xingxi2，XU Heyang2，LAN Qiusheng2，HUANG Yongliang2，CHU Zhonghua2.1Depart⁃ment of General Surgery，the First People′s Hospital of Nansha District，Guangzhou，511440，Chi⁃na；2Department ofGastroenteropancreatic Surgery，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen Universi⁃ty，Guangzhou510120，China.Corresponding author：CHU Zhonghua，chu9009@163.com

Objective To investigate role of TGF⁃beta in promoting the colorectal cancer LoVo cells invasion induced by phosphatase of regenerating liver⁃3（PRL⁃3）.M ethods ELISA assay was to used to detect the level of TGF⁃beta in LoVo⁃P and LoVo⁃C.Invasion assayswere applied to determine the effect of TGF⁃beta on the ability of PRL⁃3.Western blotwas used to detect the proteins of p⁃AKT and AKT.Results Elisa assay displayed that the protein level of TGF⁃beta of LoVo⁃Pwas higher than LoVo⁃C（114±11 pg/ml vs.56±8 pg/ml，P＜0.01）.When added different dosages of neutralizing antibody of TGF⁃beta（1，10，00 ng/m l）in culture medium of LoVo⁃P，the invasion were decreased significantly（96.1±8.2，67.3±9.4 and 48.6±6.4，respectively）and all Pvaluesless than 0.05）.Western blot reminded the proteins of p⁃AKT in LoVo⁃Pwere higher than LoVo⁃C，and the expression of p⁃AKT in LoVo⁃Pwas decreased by 2.5⁃fold after treating LoVo⁃Pwith the PI3K inhibitor LY294002（10mg/mL）（P＜0.05）.Conclusion PRL⁃3 could up⁃regulate the expression of TGF⁃beta in colorectal cancer LoVo cells and promote the invasion of LoVo cells，in which PI3K/AKT signaling pathwaymay be involved.

PRL⁃3；colon cancer；TGF⁃beta；invasion

R735.3+5

A

10.3969/j.issn.1009⁃976X.2017.03.008

2017-02-19）

广东省科技计对外科技合作项目（2013B051000025，2015A050502021）；广东省医学科研基金（B2014133）；广东省自然科学基金（2014A030313054）

1511440广州广州市南沙区第一人民医院普外科；2510120广州中山大学孙逸仙纪念医院胃肠外科

*通讯作者：褚忠华，Email：chu9009@163.com