牛肉及其制品中掺入鸡肉、鸭肉和猪肉的多重数字PCR快速检测方法研究

杨 华，汪小福，肖英平，魏 巍，徐俊锋

(浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所， 浙江 杭州 310021)

牛肉及其制品中掺入鸡肉、鸭肉和猪肉的多重数字PCR快速检测方法研究

杨 华，汪小福，肖英平，魏 巍，徐俊锋

(浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所， 浙江 杭州 310021)

利用微滴式数字PCR，建立针对牛、猪、鸡和鸭肉的多重数字PCR检测技术。结果表明，所选择的4个物种的引物和探针特异性良好，能够快速对样品中是否存在这4种肉类成分做出快速判断。数字PCR分析中，FAM和HEX两个通道的荧光信号能很好地区分，在对9个实际样品的检测中，所在样品的微滴生成数都在10 000以上，满足数字PCR中泊松公式分析的要求，同时9个样品的检测结果与已知信息完全相符。

数字PCR；肉源性成分检测；多重检测；快速检测

牛肉及其制品因其营养价值高、肉质鲜嫩爽口等特点受到消费者普遍欢迎，我国是人口大国，对牛肉及其制品的需求量逐年升高。牛肉的价格比鸡鸭肉和猪肉的偏高。在利益驱动下，有些企业和不法商贩以低价肉代替高价肉，使用其他禽畜肉为原料，通过浸泡、添加香精等加工方式处理后，冒充牛肉进行售卖[1]，从而牟取暴利，使得牛肉制品掺假问题严重，国内“挂羊头卖狗肉”现象更是屡次被媒体曝光。同时，猪肉、鸭肉等其肌纤维纹路与牛肉较为接近[2]，制成肉干、冷冻肉片等加工品后更是难以分辨，常能以假乱真，因其价格低廉，常用作牛肉掺假的原料。传统的感官分辨肉质品种的方法不能满足检测要求，因此迫切需要建立牛肉及其制品中掺入其他肉源性成分的检测技术。

数字PCR(Digital PCR)的概念于1992年提出[3]，其基本原理是通过将微量样品进行大倍的稀释和分液，直至每个扩增区域含有目标扩增分子为0、1或1个以上，再进行PCR扩增，根据扩增信号的有无，利用泊松分布(Poisson distribution)[4]计算出样本的最初拷贝数或浓度。数字PCR不依赖扩增效率及标准曲线的定量，且对一些PCR抑制因子的耐受性更高。该技术在基因拷贝数分析、基因表达分析、基因分型等方面都取得了突破性进展[5-6]。在动物源性成分检测方面也有相应研究报道，表明数字PCR在动物源性成分检测方面的可行性[7]。然而，目前的研究多数是针对单一动物源性成分的检测，无法满足对肉制品中多种动物源性成分检测的需要。

本研究针对牛肉及其制品中可能掺入鸡肉、鸭肉和猪肉的情况，建立数字PCR针对牛肉、鸡肉、鸭肉和猪肉的4重数字PCR检测方法，将检测牛肉的探针在5端标记为FAM，3端标记为BHQ1，而检测鸡肉、鸭肉和猪肉的探针在5端均标记为HEX，3端标记为BHQ1。检测样品中若含有牛肉成分，则FAM通道能检测到相应的荧光；反之，样品中若无牛肉成分，则FAM通道无法检测到荧光。若样品中含有鸡肉、鸭肉或猪肉中任何1种成分，则HEX通道有荧光检出；若样品中不含鸡肉、鸭肉和猪肉成分，则没有荧光检出。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验中的纯肉样品(牛、羊、鱼、猪、狗、鸡、鸭、马)购于市场，检测样本1～9号为本实验室收集的实际样本，其动物源性成分已知。其中1～3号样品只含有牛肉成分，4，5号样品含有牛肉和猪肉成分，6，8号含有牛肉和鸭肉，7号样品含有牛肉、猪肉、鸡肉和鸭肉成分，9号样品含有牛肉和鸡肉成分。

基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；ddPCR Master Mix，Droplet Generation Oil，Droplet Reader Oil(Bio-Rad，美国)。

1.2 试验仪器

Nanodrop ND-2000核酸蛋白定量仪(Thermo Scientific，美国)。DY-501型核酸电泳仪(上海精密科学仪器有限公司，上海)。QX100TMDroplet，Digital TM PCR系统(Bio-Rad，美国，包括微滴生成仪和微滴读取仪)。ABI 7500定量PCR仪(Applied Biosystem，美国)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

所有样品基因组DNA提取使用天根公司的动物组织DNA提取试剂盒，具体步骤见试剂盒说明书。所得基因组DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop ND-2000核酸蛋白定量仪评价。

1.3.2 引物和探针

试验中应用的引物和探针来自相应的文献报道[8-11]，引物和探针由上海英俊生物科技有限公司合成，其核苷酸序列等信息见表1。

1.3.3 定量PCR体系及反应条件

定量PCR反应体积为25 μL，12.5 μL 2×TaqMan通用Mix，DNA模板(5 μL)，引物各300 nmol·L-1，100 nmol·L-1探针和5.2 μL的水。定量PCR扩增的反应条件为95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，共45个循环。每个试样做3个平行反应，重复3次。

1.3.4 数字PCR反应体系和条件

表1 引物与探针信息

Table 1 Information of primers and probes

检测目标Detectiontargets引物名称Name序列(5'→3')Sequences参考文献Reference牛Beef-FCCGATGGATGTGTTCAGAGCT[8]BeefBeef-RGCCAAATGTCTGGGTGTAGAT-ACCBeef-PaTGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGT-GAA鸡Chicken-FCCAACATGCCTTTAAACCCTCA[9]ChickenChicken-RGGAACTGTAGCCTTCTGACTCGChicken-PbTGCCTTTCCTTCCCCGC-CAGTCTC鸭Duck-FGGCCTCCTACTGGCTATGCA[10]DuckDuck-RGAGTCAGCCATATTGGACGTTTDuck-PbCACCGCAGACACATCCCTT-GCTTTCT猪Pork-FCGAGAGGCTGCCGTAAAGG[11]PorkPork-RTGCAAGGAACACGGCTAAGTGPork-PbTCTGACGTGACTCCCCGACCT-GG

a，探针5′端和3′端分别标记报告基团FAM和淬灭基团BHQ1；b，探针5′端和3′端分别标记报告基团HEX和淬灭基团BHQ1。

a, Probe were labeled with 5′-FAM and 3′-BHQI; b, Probes were labeled with 5′-HEX and 3′-BHQI

微滴数字PCR反应包括配制体系、生成微滴、扩增循环和信号读取4个步骤。优化后的多重数字PCR的扩增体系见表2。微滴生成需要使用专门的微滴生成卡和微滴生成仪，将20 μL PCR体系和70 μL微滴生成油(droplet generation oil)加入微滴生成卡，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪，生成微滴。

微滴数字PCR扩增使用两步法。94 ℃预变性10 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，共40个循环，扩增结束后进行98 ℃、10 min热失活，每个模板重复3个平行检测。扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中读取信号，并使用软件Quanta Soft V1.6.6分析试验数据，获得绝对定量结果。

2 结果与分析

2.1 引物与探针的特异性分析

利用荧光定量PCR的方法，分别用牛、猪、鸡和鸭的各自的特异性引物与探针扩增不同纯肉品(牛、羊、鱼、猪、狗、鸡、鸭、马)中的DNA成分，扩增结果如图1所示。

表2 多重数字PCR扩增体系

Table 2 The amplification system for multiple digit PCR

试剂Reagents终浓度/(nmol·L-1)Finalconcentration体积/μLVolumeddPCRMasterMix2×10Beef-F2500.5Beef-R2500.5Beef-P1500.3Chicken-F3000.6Chicken-R3000.6Chicken-P1500.3Duck-F2500.5Duck-R2500.5Duck-P1500.3Pork-F3000.6Pork-R3000.6Pork-P1500.3DNA模板—1μL每个物种ddH2O——总体积—20

不足体积以ddH2O补齐。

Polishing the insuffiaent volume with ddH2O.

在图1A中，利用牛肉的特异性引物和探针扩增不同纯肉样品的DNA，纯牛肉的样本中有特异的扩增曲线，而其他纯肉样品中未观察到有牛肉特征曲线。同样在图1的B、C和D中，相应的特异性引物和探针只是在对应的纯肉样品中得到相应的扩增曲线，而在其他纯肉样品中未观察到有特征曲线。试验结果表明，所选择的引物和探针具有很好的物种特异性。

A，牛肉的引物和探针的特异性分析结果；B，鸡肉的引物和探针的特异性分析结果；C，鸭肉的引物和探针的特异性分析结果；D，猪肉的引物和探针的特异性分析结果。A，The result of specificity analysis for beef primer and probe; B，The result of specificity analysis for beef primer and probe; C，The result of specificity analysis for beef primer and probe; D，The result of specificity analysis for beef primer and probe.图1 引物和探针的特异性分析Fig.1 Specificity analysis of primers and probes

2.2 多重荧光定量PCR分析

利用荧光定量PCR扩增优化后的多重数字PCR体系，分析多重扩增体系的可扩增性。扩增体系中含有分别针对牛、猪、鸡和鸭的特异性引物与探针，在扩增体系中加入相应的DNA模板，分别为牛和猪的DNA，牛和鸡的DNA，牛和鸭的DNA，以及同时含有牛、猪、鸡和鸭的DNA。

如图2所示，在含有相应DNA模板的扩增体系中，均呈现相应的扩增曲线。当体系中同时含有牛、猪、鸡和鸭的DNA时，因猪、鸡和鸭的探针都是同一荧光标记(HEX)，因此对猪、鸡和鸭的扩增是同一扩增曲线。多重荧光定量PCR分析结果表明了多重扩增体系的可行性。

2.3 多重数字PCR扩增体系的建立

多重数字PCR扩增体系按表2配制，分别配制4个反应。在Ⅰ反应中加入牛和鸡的DNA，在Ⅱ反应中加入牛和鸭的DNA，在Ⅲ反应中加入牛和猪的DNA，在Ⅳ反应中同时加入牛、猪、鸡和鸭的DNA。如图3所示，在FAM通道中，4个反应体系中都扩增出牛肉信号；在HEX通道中，Ⅰ～Ⅳ反应中分别扩增出相应的样品信号。在2个荧光通道中，阳性微滴和阴性微滴区分很明显，后期分析中，满足数字PCR的分析要求。

同时分析了反应Ⅳ的二维散点图谱。如图4所示，从扩增结果看，2个通道中的反应均得到良好扩增，且信号值满足分析要求。

2.4 多重数字PCR扩增体系对实际样品的检测

利用建立的多重数字PCR对1～9号实际样品进行检测分析。由表3可知，在数字PCR扩增中，要求每孔微滴生成数大于8 000个才纳入统计分析，含有扩增信号的阳性微滴与未扩增的阴性微滴用荧光阈值来区分，利用QuantaSoft分析各反应孔中FAM和HEX的荧光信号值，通过泊松分布公式计算出各反应中相应样品的拷贝数。在本试验中，样品微滴生成数在15 127～19 397之间。其中1～3号样品针对牛肉成分的FAM通道中，阳性微滴分别为7 244，4 034，3 803，通过QuantaSoft软件泊松分析，其中牛肉基因组的拷贝数分别为612，295和287，表明1～3号样品中含有牛肉成分；而在HEX通道中没有检测到阳性微滴，表明1～3号样品中不含有猪肉、鸡肉和鸭肉成分。在4～9号样品中，针对牛肉成分的FAM通道均有相应阳性微滴生成，并检测出相应的牛肉基因组的拷贝数，而在针对猪肉、鸡肉和鸭肉的HEX通道中，也有相应的阳性微滴生成，表明4～9号样品中至少含有猪肉、鸡肉或鸭肉中的1种肉源成分。检测结果与样品的已知信息相符合。

图中鸭肉、猪肉和鸡肉指示的分别为相应的肉源成分在荧光定量PCR体系中的扩增曲线，而鸭、鸡、猪指示的是荧光定量PCR体系中同时含有这3种肉源成分的扩增曲线，而牛肉指示的是在所有荧光定量PCR体系中牛肉成分的扩增曲线。Duck，pork and chicken indicate the amplification curves of the corresponding meat ingredients in the fluorescence quantitative PCR system，respectively，while the duck，chicken and pork indicate the presence of these three meat ingredients in the fluorescence quantitative PCR system，and the beef indicates the amplification curve of the beef composition in all the fluorescent quantitative PCR systems.图2 多重荧光定量PCR分析Fig.2 The result of multiple fluorescence quantitative PCR analysis

图3 多重数字PCR扩增Fig.3 Amplification of multiple digital PCR

图4 多重数字PCR扩增的二维散点图分析Fig.4 Two dimensional(2D)scatter plot of multiple digital PCR amplification

3 讨论

目前，基于DNA对动物源性成分分析的方法主要为PCR方法，包括普通PCR方法和实时荧光PCR方法，普通PCR方法需要对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶分析，操作繁杂，历时较长，常作定性分析，特异性和灵敏度都有待提高。实时荧光PCR省去了琼脂糖凝胶分析，实时分析样品扩增情况的灵敏度较高，若利用Taq-Man探针，其特异性也显著提高，因此目前广泛应用到肉种鉴别及其他食用安全成分的检测。

表3 多重数字PCR对实际样品的检测结果

Table 3 Detection of actual samples by multiple digital

样品号Samplenumber目标信号Targetsignal微滴检测Dropletdetection可接受值Accepted阳性微滴Positives阴性微滴Negatives泊松统计Poissonstatistics最大值Maximum最小值Minimum1μL中的拷贝数CopiesperμL1FAM17867724410623626598612HEX17867017867--02FAM18181403414147304286295HEX18181018181--03FAM17591380313788296277287HEX17591017591--04FAM16642323213410263245254HEX166421861645615.111.313.25FAM19397427715120302284293HEX193973609157882502341426FAM1512761109017624593609HEX1512781150467.856.37FAM17047384513202310291301HEX170473583134642872692788FAM19096360115495254238246HEX190962041889214.410.912.69FAM17919339514524255239247HEX179191491777011.48.29.8

然而实时荧光PCR在定量分析时需建立标准曲线，一方面有些标准品非常昂贵，有的本身就很稀少，难以获取；另一方面，标准品与检测样品之间的差异也会影响最终定值。已有研究报道，在分析牛肉丸中牛肉成分含量时，由于样品DNA受各种因素的影响，如牛的性别、年龄、部位及加工过程所采用的加工工艺、配料(增稠剂、防腐剂等)的不同，可能导致牛肉丸中DNA得率不同，导致配制的标准品中牛肉含量与实际情况不符[12]。为了节约成本，减少检测时间，有时需要建立多重检测体系，目前主流的荧光PCR仪，一般都有4～5个不同荧光的通道，理论上可做到同时针对4～5个不同靶标的多重实时荧光检测。然而，由于在扩增时所有引物和探针及样品都在同一扩增体系中，无法避免彼此间相互干扰，极大影响了多重检测的实际应用性。

数字PCR是继普通PCR和实时荧光PCR后又一革新的PCR技术，通过将微量样品进行大倍的稀释和分液，使每个扩增区域含有目标扩增分子为0、1或1个以上，相当于将扩增体系分成上万个独立的扩增体系，扩增后对扩增信号进行泊松分布分析，从而计算出样本的最初拷贝数或浓度，做到对检测样品的绝对定量，而且不需要建立标准曲线，由于只是针对扩增信号有和无的分析，对PCR的扩增效率要求不高，从而对样品的耐受性更高。另一方面，由于其对起始扩增体系进行多倍分液，适合建立多重检测体系，进行分液或是隔离后，不同靶标的扩增还是在各自独立的体系中扩增，相互间干扰较少。

本研究利用数字PCR的这些特点，建立了针对牛、猪、鸡和鸭肉的多重检测，可同时检测这4种肉源性成分，且能绝对定量到相应的拷贝数。目前其主要不足表现在两个方面，一是由于目前的数字PCR仪只能分析2个通道的荧光，如Bio-Rad的微滴式生成数字PCR，只能分析FAM和HEX这两个通道。因此在本研中，对猪、鸡和鸭肉成分利用HEX标记检测，虽能对这3种成分进行检测分析，但不能将这3种成分进行区分。尽管目前也有研究利用EvaGreen荧光分析扩增，通过扩增后不同扩增靶标的荧光值的不同来区分不同靶标，从而提高数字PCR通量[13]，但这种方法需要筛选适合的引物及复杂的体系调配，同时其特异性也有待提高。另一方面，虽然本研究建立的方法能获得肉源成分的绝对拷贝数，但目前还不能通过对样品中不同肉源性成分的DNA拷贝数比来计算出其组分的质量比。随着数字PCR及其他分子生物学技术的不断发展和日趋完善，数字PCR技术在动物源性成分检测及其他领域将会具有更大的应用前景。

[1] XU B，LI P，MA F，et al. Detection of virgin coconut oil adulteration with animal fats using quantitative cholesterol by GC×GC-TOF/MS analysis [J].FoodChemistry，2015，178:128-135.

[2] 葛忠源. 各种食品动物肉种鉴别[J]. 青海畜牧兽医杂志，2014，44(2)：55-56. (in Chinese) Ge Z Y. Identification of various kinds of food animal meat [J].ChineseQinghaiJournalofAnimalandVeterinarySciences，2014，44(2)：55-56.

[3] SYKES P J，NEOH S H，BRISCO M J，et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution[J].Biotechniques，1992，13(3)：444.

[4] PINHEIRO L B，COLEMAN V A，HINDSON C M，et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification[J].AnalyticalChemistry，2012，84(2)：1003.

[5] HINDSON B J，NESS K D，MASQUELIER D A，et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number[J].AnalyticalChemistry，2011，83(22)：8604-8610.

[6] HUI T，CAI Q，HU L，et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantification of hepatitis B virus DNA[J].BioscienceBiotechnology&Biochemistry，2016，80(11)：2159-2164.

[7] 王珊，李志娟，苗丽. 微滴式数字PCR与实时荧光PCR检测羊肉制品中羊源和猪源性成分方法的比较[J]. 肉类工业，2015(7)：38-41. WAN S，LI Z J，MIAO L. Comparison of microsphere digital PCR and real-time fluorescence PCR for detection mutton-derived and porcine derived ingredients in mutton products [J].MeatIndustry，2015(7)：38-41. (in Chinese with English abstract)

[8] GB/T 25165—2010，明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法[S]. GB/T 25165-2010，Qualitative detection of cattle，sheep and pig-derived ingredients in gelatin real-time fluorescent PCR method[S].

[9] 胡智恺，宋丽萍，姜洁，等. 实时定量PCR法对牛肉中鸡源性成分的量化检测[J]. 食品安全质量检测学报，2015(2)：550-554. HU Z K，SONG L P，JIANG J，et al. Real-time PCR method for quantitative detection of chicken blending in beef [J]JournalofFoodSafetyandQuality，2015(2)：550-554. (in Chinese with English abstract)

[10] 张驰，邱皓璞，张筠. 荧光定量PCR检测肉制品中鸭源性成分[J]. 食品科学，2013，34(18)：154-157. ZHANG C，QIU H P，ZHANG Y. A real-time PCR detection method for duck ingredient in meat products [J].FoodScience，2013，34(18)：154-157. (in Chinese with English abstract)

[11] 董洋洋. 实时荧光PCR对牛肉中掺入鸭肉和猪肉的定量检测研究[D]. 大庆：黑龙江八一农垦大学，2016. Dong Y Y. Quantitative Detection of Duck and Pork in Beef by Real-time Fluorescent PCR [D]. Daqing: Heilongjiang Bayi Agricultural University，2016. (in Chinese with English abstract)

[12] 柳彬，杨金易，许婉，等. “牛肉”制品中牛肉含量的快速检测 [J]. 食品科学，2013，34(24)：148-153. LIU B，YANG J Y，XU W，et al. Development and application of a method for rapid detection of beef content in commercial beef products [J].FoodScience，2013，34(24)：148-153.(in Chinese with English abstract)

[13] MIOTKE L，LAU B T，RUMMA R T，et al. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR [J].AnalyticalChemistry，2014，86(5)：2618-2624.

(责任编辑 张瑞麟)

Rapid detection of chicken，duck and pork blending in beef products by multiple digital PCR

YANG Hua， WANG Xiaofu， XIAO Yingping， WEI Wei，XU Junfeng

(InstituteofQualityandStandardforAgro-products,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

In this study，a quickly detective method，using droplet digital PCR，for detection of beef，chicken，duck and pork was established. The results showed that the selected primers and probes for the four species had good specificity，and could quickly make out these four kinds of mean component in tested samples. In all of the digital PCR analysis， the fluorescence signals of FAM and HEX can be well distinguished. For detection of 9 samples，the numbers of droplets generated in the multiple digital PCR were all above 10 000， which could meet the requirements for the poisson formula analysis in digital PCR. meanwhile，the test results of the 9 samples using multiple digital were consistent with the known information of these samples.

digital PCR；meat components detection；multiple detection；quickly detection

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.20

2017-04-24

浙江省自然科学基金(LZ15C170001)

杨华(1972—)，男，浙江绍兴人，硕士，高级畜牧师，主要从事畜产品质量安全研究。E-mail: yanghua806@hotmail.com

Q-331

A

1004-1524(2017)06-0994-07