实时荧光定量PCR检测非小细胞肺癌组织中SP70及MTA1的表达及意义

梁祥森 陈 波 胡应学 冯 震 梁运宁

（广西医科大学第六附属医院心胸外科，广西 玉林 537400）

实时荧光定量PCR检测非小细胞肺癌组织中SP70及MTA1的表达及意义

梁祥森 陈 波 胡应学 冯 震 梁运宁

（广西医科大学第六附属医院心胸外科，广西 玉林 537400）

目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）组织中SP70抗原及肿瘤转移相关基因（MTA1）的表达及意义。方法采用实时荧光定量PCR相对标准曲线法检测40例NSCLC组织和20例良性病变肺组织中SP70及MTA1的表达水平，定量分析其与临床及病理学特征的关系，比较二者的应用价值。结果NSCLC组SP70及MTA1平均表达水平均明显高于肺良性病变组（1.768±0.275、1.546±0.382 vs 0.921±0.238）pmol/µL（P＜0.05），其中SP70与MTA1的表达呈正相关（r=0.458，P＜0.05），SP70平均表达水平高于MTA1（1.768 ±0.275）vs（1.546±0.382）pmol/µL（P＜0.05）；SP70及MTA1的表达水平与肺癌的临床分期及淋巴结转移情况有关（P＜0.05），与患者年龄、性别、肿瘤分化程度无关（P＞0.05）。结论SP70及MTA1均是评价NSCLC的潜在指标，SP70可能优于MTA1。

SP70抗原；肿瘤转移相关基因（MTA1）；非小细胞肺癌

早期诊治对肺癌的治疗尤为关键，近期潘世扬等[1-2]研究发现一株能特异性识别NSCLC的McAbNJ00l，其所针对的靶抗原为相对分子质量70000的胞质新抗原SP70，SP70与NSCLC关系密切。MTA1是肿瘤转移相关基因，已有大量研究[3-5]证实其在NSCLC癌细胞侵袭和转移过程中意义重大。本实验采用实时荧光定量PCR（Q-PCR）相对标准曲线法检测40例NSCLC组织和20例良性病变肺组织中SP7O和MTA1的表达水平，定量分析其表达与NSCLC临床与病理特征的关系，比较二者在临床诊治中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 基本资料：取我科2014年8月至2015年6月手术切除的并经病理确诊的NSCLC标本40例和20例肺良性病变组织，标本收集后立即保存于-80℃冰箱。Trizol液和逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司。TSYBR GreenI荧光染料：北京天根公司。引物由北京诺赛基因公司设计并合成，目的基因SP70 F：5'- CCAGTTCAAGTGCTCGG CAT-3'；R：5'-TTGCTC TTGGAACCTCGGAC-3'。MTA1 F：5'-CAGCTACGAGCA GCACAACG-3'；R：5'-TGTCCGTGGTTTGC CAGA-3'。内参β-actin F：5'-GTGACGTTGACATC CGTAAAGACC-3'；R：5'-CTAG GAGCCAGGG CAGTAATCT -3'。荧光定量PCR仪：Step one V2.1 （美国ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成：按Trizol裂解抽提法提取总RNA，常规检测其纯度、浓度及完整性。将RNA逆转录合成cDNA后存放-20 ℃冰箱。

1.2.2 标准曲线的制备：通过吸附柱式琼脂糖DNA回收法将PCR产物目的条带进行回收纯化，常规测定其浓度，再以10倍系列梯度进行连续倍比稀释成106～101copies/µL数量级的标准品，实时荧光定量PCR扩增后生成标准曲线。

1.2.3 相对标准曲线法实时荧光定量PCR扩增：每份标本均扩增SP70、MTA1及β-actin，20 µL反应体系：SYBR GreenI reaction mixture：10 µL，目的基因（10pmol/µL）上、下游引物各0.4 µL，cDNA模板2 µL，ddH2O：17.2 µL。反应条件：94 ℃预变性2 min，然后94 ℃20 s，58 ℃30 s，68 ℃45 s共40个循环，扩增完成后自动进行溶解曲线分析，每份标本重复3次，通过扩增曲线及溶解曲线判定结果是否符合实验要求。

1.2.4 数据的标化处理：以同一样本β-actin的模板量为参照，标化计算SP70及MTA1的相对模板数，即SP70/β-actin和MTA1/β-actin。

1.2.5 统计学方法：用SPSS18.0软件对实验数据进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，样本均数的比较采用两独立样本均数t检验，SP70及MTA1相关性分析用Pearson线形相关检验，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结果评价：目的基因SP70、MTA1及内参β-actin的标准曲线线性关系良好，扩增效率均为R2＞0.995以上，三基因PCR扩增产物均在大于87.0 ℃以上获得单一熔解峰，特异性好，经琼脂糖电泳确认为目的基因扩增条带。

2.2 实验结果：NSCLC组SP70、MTA1平均表达水平明显高于肺良性病变组（1.768±0.275、1.546±0.382 vs 0.921±0.238）pmol/µL，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中SP70与MTA1的表达呈正相关（r=0.458，P＜0.05），SP70平均表达水平高于MTA1 （1.768±0.275）vs（1.546±0.382）pmol/µL，差异有统计学意义（P＜0.05）；SP70、MTA1的表达水平与肺癌临床分期及淋巴结转移情况有关（P＜0.05），与患者年龄、性别及肺癌分化程度无关 （P＞0.05），见表1。

3 讨 论

相关研究[1-2,6]指出SP70是一种针对NSCLC的特异性蛋白靶标，其存在于癌细胞的胞膜和胞质，可促进癌细胞增殖，是肺癌检测诊断的分子靶标，同时也是抗肺癌治疗靶点，SP70对于NSCLC的诊治意义重大。彭蘡[6]等采用ELISA方法检测发现NSCLC患者中外周血液中SP70阳性率明显高于对照组，提示SP70可能是诊断NSCLC的潜在血清肿瘤标志物。亦有研究[7-9]发现恶性胸腔积液中SP70的检出率明显增高，且NSCLC患者胸腔积液中SP70检出率高于小细胞肺癌患者，证实了SP70与NSCLC的密切关系。已有大量深入研究[3-5]证实肿瘤转移相关基因MTA1与NSCLC癌细胞的侵袭和转移关系密切。采用实时荧光定量PCR联合检测NSCLC组织中SP70及MTA1 mRNA表达水平的相关研究尚未见报道。本研究采用实时荧光定量PCR双标准曲线法联合检测NSCLC组织中SP70及MTA1 mRNA表达水平，比较二者在临床诊治中的应用价值，以MTA1为参照进一步探讨SP70与NSCLC的关系。

实验结果提示内参β-actin在各检测样本中均阳性表达，为实验数据的可靠性提供了依据。研究发现NSCLC组SP70及MTA1平均表达水平明显高于肺良性病变组，与既往研究[3]结论一致，证实了SP70与NSCLC的密切关系；本研究还发现SP70、MTA1的表达水平与临床分期及淋巴结转移情况有关，其中SP70与MTA1的表达呈正相关，提示在NSCLC组织中SP70与MTA1的表达关系密切且为正相关，鉴于MTA1已有大量研究[3-5]证实其与NSCLC的密切关系，所以以MTA1为参照可以从侧面推断SP70与NSCLC的关系，本实验初步证实了SP70与NSCLC临床特征的关系，其中SP70平均表达水平高于MTA1，提示SP70具有更高的灵敏度，可能是优于MTA1的评价NSCLC的潜在指标。此外，SP70抗原在胞质中和胞膜上均有表达，胞质中表达量更丰富，抗癌药物的作用靶点更为广泛，其潜在临床意义重大。本实验是基于基因水平的研究，从基因到蛋白的过程可能会发生一些逆转性变化，而且本研究样本量较少，随访时间短，本研究的结论需进一步证实，有待于加大样本量，加强随访，同时监测SP70在外周血液中的表达情况，从蛋白水平进一步研究，可能会发现SP70与NSCLC的作用机制以及预后的关系。

表1 SP70及MTA1的表达与NSCLC临床特征的关系（±s）

表1 SP70及MTA1的表达与NSCLC临床特征的关系（±s）

病理学参数例(n)SP70 mRNAt值P值MTA1 mRNAt值P值男242.06±0.371.6080.1151.55±0.271.2080.144女161.47±0.441.43±0.36＜60岁181.64±0.12-0.9810.3351.62±0.23-0.650.521≥60岁221.88±0.431.82±0.19有淋巴结转移181.99±0.34-1.9770.0241.89±0.47-2.650.016无淋巴结转移221.02±0.210.92±0.59高分化291.49±0.29-1.4120.1481.41±0.260.0720.943低分化112.11±0.291.76±0.37Ⅰ+Ⅱ期211.42±0.15-2.2290.0141.03±0.34-0.1180.027Ⅲ+Ⅳ期192.19±0.441.95±0.45

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R734.2

B

1671-8194（2017）15-0028-02

广西医科大学青年科学基金资助项目 (GXMUYSF 201339)