双齿围沙蚕消化道降油细菌的分离鉴定及降油性能研究

王绪磊+陈弘昊+王斌

摘要： 從采自辽宁大连地区的双齿围沙蚕消化道分离得到3株能利用柴油为唯一碳源的石油降解菌，编号分别为，编号为SC11-32-2，SC11-37，SC11-38。通过形态学和16S rDNA序列比对对菌株进行鉴定，结果显示：SC11-32-2菌株16S rDNA序列与Pseudomonas monteilii同源性为99.9%，SC11-37菌株16S rDNA序列与Vibrio alginolyticus同源性为99%，SC11-38菌株16S rDNA序列与Pseudomonas composti同源性99%。继而测定了不同浓度（107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL）分离菌对柴油的降解率，以及加入葡萄糖后不同浓度（107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL）分离菌对柴油的降解率。结果显示：SC11-32-2菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为26.31%、44.52%、51.26%；SC11-37菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为7.89%、19.22%、23.36%；SC11-38菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为12.32%、27.33%、35.56%；加入终浓度为4g/L葡萄糖后，3株菌对柴油的降解率均有显著提高，SC11-32-2菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为87.56%、88.33%、88.62%；SC11-37菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为67.88%、69.12%、70.38%；菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为75.67%、78.35%、79.56%。

关键词：双齿围沙蚕； 石油降解菌； 降油率

中图分类号：Q48 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2017）03-0177-04

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.03.096

Abstract： In this study， 3 strains of oil-utilizing bacteria were isolated from the digestive tract of Pernereis aibuhitensis collected from DaLian， Liaoning， China through medium containing diesel oil as a sole source of carbon.， named SC11-32-2， SC11-37， SC11-38. Cellular morphological observations and molecular indentifications of 16S rDNA were used to identify strains SC11-32-2， SC11-37 and SC11-38. The results showed that strain SC11-32-2 belonged to the genus Pseudomonas monteilii， and the homology is 100%；strain SC11-37 belonged to the genus Vibrio alginolyticus， and the homology is 99%；strain SC11-32-2 belonged to the genus Pseudomonas composti， and the homology is 99%.The initial diesel oil-degrading efficiency of different inoculation quantity was detected， meanwhile the oil-degrading efficiency was studied when glucose was added. The results showed that the initial diesel oil-degrading efficiency of SC11-32-2 in the inoculation quantity of 107cfu/mL， 108cfu/mL， 109cfu/mL was 26.31%， 44.52% and 51.26%， respectively. And significantly increased to 87.56%， 88.33% and 88.62% after adding 4 g/L glucose， In the same situation， the diesel oil-degrading efficiency of SC11-37 increased from 7.89%，19.22% and 23.36% to 67.88%， 69.12% and 70.38% in three inoculation levels. The diesel oil-degrading efficiency of SC11-38 increased from 12.32%， 27.33% and 35.56% to 75.67%， 78.35% and 79.56% in three inoculation levels.

Key words： Perinereis aibuhitensis； petroleum-degrading bacteria； degradation

1 研究背景

作为近海常见的主要环境灾害之一，海洋溢油污染已经给人们正常的生产生活带来长期的影响，因此海洋溢油的生物降解也因此受到世界各国的重视。中国近年来海洋溢油污染趋势不断加大，对海洋生态环境带来巨大的破坏和威胁，已经严重危害到我国沿海地区工农业及海洋产业的可持续发展[1]。利用微生物修复被污染环境是目前研究最多、应用最多的治理方法。自然界中目前已知的可以降解石油污染物的微生物类群多达200多种[2，3]，据报道，目前已经分离筛选出可以降解石油类污染物的主要菌群有：假单胞菌Pseudomonas[4]，不动杆菌Acinetobacter[5]，短杆菌Brevibacterium，芽孢杆菌Bacillus[6]等。通过微生物对石油污染物的生物降解的菌源大多分离自海洋沉积物、海水、海冰、土壤样品[7-10]，而对于耐污染的无脊椎动物消化道附着降油微生物的研究目前还未见报道。双齿围沙蚕（Pernereis aibuhitensis）是重要的海洋沉积食性无脊椎动物，广泛的分布于中国沿海滩涂和河口沉积物中。双齿围沙蚕可以蓄积环境中的有机污染物并通过自身的生物转化作用分解和代谢污染物，是海洋沉积环境早期污染生态风险评价的指示生物和生态毒理学研究中重要的模式生物[11-13]。分离结果显示，无脊椎动物中附着微生物中具有生物活性菌株的分离比率高于海水及沉积物的分离比率[14]，因此通过对双齿围沙蚕消化道附着微生物中降油菌株的分离筛选可以提供新的优良降油菌源。本研究通过分离双齿围沙蚕消化道附着微生物，继而从中筛选出具有降解石油污染物能力的菌株，为制备用于海洋石油污染修复的复合菌剂提供菌种，同时也为探索以沙蚕为载体的定植降油细菌用于海洋环境中石油污染的生物修复奠定基础。

2 材料与方法

2.1 双齿围沙蚕样品及培养基

实验所用双齿围沙蚕采自辽宁大连金州沿海潮间带，体重约4g，采样后暂养于无菌海水中。菌株初筛使用2216E固体培养基，菌株复筛使用柴油平板培养基，测定菌株柴油降解率使用基础无机盐培养基[15]。

2216E培养基：蛋白胨5g、酵母膏1g、琼脂粉20g、FePHO4 0.01g、陈海水1000ml，pH7.6-7.8，121℃高压灭菌20min。

基础无机盐培养基：NaCl 20g、KH2PO4 1g、K2HPO4 0.5g、NH4Cl 0.5g、MgSO4 0.5g、KCl 0.1g、FeSO4 0.01g、CaCl2 0.002g、纯水1000mL，pH7.2，121℃高压灭菌20min。

柴油平板培养基：基础无机盐培养基1000mL、琼脂粉20g、吐温80mL、0号柴油10mL，pH7.2，121℃高压灭菌20min。

斜面保种培养基（2216E）：蛋白胨5g，酵母膏1g，琼脂粉15g，FePHO4 0.01g，陈海水1000ml，pH7.6-7.8，121℃高压灭菌20min。

2.2 石油降解细的筛选分离

将采集到的双齿围沙蚕样品在无菌海水中暂养24h，使其充分排尽肠道内容物后，然后放入10%乙醇溶液中进行麻醉。将麻醉后的沙蚕放入超净工作台解剖盘中，用75%的乙醇对其体表进行消毒，使用灭菌海水冲洗后，用无菌剪刀、解剖刀、镊子取出双齿围沙蚕消化道，将取出的双齿围沙蚕消化道样品置于5mL灭菌离心管中，加入2mL无菌海水并用匀浆器匀浆，对匀浆进行梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5），取各稀释梯度样品各100?L分别涂布于2216E平板上，25℃培养1-2天，根据不同菌落形态挑菌行纯化，每株菌纯化3代后保种于2216E斜面用作初筛降油菌株。将沙蚕消化道分离菌分别用滴注法接种到以柴油为唯一碳源的平板培养基上，25℃恒温培养箱培养2-3天。待平板上长出清晰菌苔，从中挑选出生长状况良好的菌株作为石油降解初筛菌株进行后续实验。

2.3 16S rDNA序列的扩增、测序及系统发育树的构建

使用上海生工的DNA Kit提取分离菌株总DNA。采用细菌16S r DNA基因 V4+V5区的通用引物进行PCR扩增，PCR扩增产物样品送上海生工进行测序。将测序所得各菌株16SrDNA序列采用邻接法使用MEGA 5.05软件构建系统进化树，并通过自举分析进行置信度检测，自举数为1000次。

2.4 细菌原始降油率测定

将筛选到的菌株用2216E斜面培养基培养24小时后，用无菌生理盐水洗脱，配制成菌悬液（约2×109 cfu/m L），用血球计数板计数后梯度稀释，选择菌数为107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL的菌悬液以100?L接菌量接种于100 mL以柴油为唯一碳源的MMC培養基中，150 r/min，25℃恒温摇床培养7天，以不接种菌液的培养基作为对照组，每组设置三个平行。通过石油醚萃取剩余柴油和紫外分光光度法测定221nm的吸光值（OD221nm）计算降解率。根据下面的公式计算出降解率：降解率（D）=（A0-Ai）/A0，其中D为柴油降解率，A0为对照组柴油吸光值，Ai为实验组剩余柴油吸光值。

2.5 测定葡萄糖对石油降解菌降油率的影响

分别按107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL3个浓度将实验菌接种于葡萄糖终浓度为4g/L的MMC培养基，接种量为100?L，不接种菌液的培养基作为对照组，每种接菌量设置三组平行实验。将接种菌液的三角烧瓶置于150 r/min ，25℃恒温摇床中培养7天，以2.4所述方法测定柴油降解率，比较添加葡萄糖情况下菌株对柴油降解率的变化。

3 结果

3.1 石油降解菌的筛选

实验共分离8株不同菌落形态的菌株，其中3株菌可在以柴油为唯一碳源的平板培养基中生长，编号分别为SC11-32-2，SC11-37，SC11-38。25℃条件下在2216E平板上培养24h后，SC11-32-2菌落形态呈乳白色圆形，边缘齐整，不透明，直径1.5-2.0mm，经革兰氏染色该菌株镜下为革兰氏阴性菌。SC11-37菌株菌落形态呈淡棕色，菌落形状不规则，不透明，直径1.0mm，革兰氏染色后镜下显示为革兰氏阴性菌。SC11-38菌株菌落形态呈乳白色圆形，边缘齐整，不透明，直径1.0mm，革兰氏染色后镜下显示为革兰氏阴性菌。

3.2 菌株16S rDNA序列及系统发育树

将通过PCR扩增出的3株菌的16SrDNA序列送上海生工测序，测序结果经NCBI数据库Blast后发现SC11-32-2菌株16SrDNA序列与Pseudomonas monteilii同源性为99.9%，SC11-37菌株16S rDNA序列与Vibrio alginolyticus同源性为99%，SC11-38菌株16SrDNA序列与Pseudomonas composti同源性为99%。通过Mega5.05 软件进行多序列比对然后采用邻接法构建系统发育树，结果如图1，通过下图可以看出，菌株SC11-32-2与 Pseudomonas monteilii 聚为一枝；菌株SC11-37 Vibrio alginolyticus与聚为一枝；菌株SC11-38与Pseudomonas composti聚为一枝。

3.3 菌株不同接菌量初始降解率的测定

SC11-32-2、SC11-37及SC11-38菌株不同接种量条件下初始降解率如图2所示。由图可见，随着接菌量的增加，3株菌对柴油的降解率均由不同程度升高。其中SC11-32-2菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为26.31%、44.52%、51.26%；SC11-37菌在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为7.89%、19.22%、23.36%；SC11-38菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为12.32%、27.33%、35.56%。使用SPSS软件进行差异性计算，结果显示接种量为107cfu/mL 时，柴油降解率与108cfu/mL、109cfu/mL柴油解率差异显著（P<0.05），接种量在108cfu/mL、109cfu/mL时降解差异不显著（P>0.05）。

3.4 添加葡萄糖对菌株降油率的影响

在以柴油为唯一碳源的MMC培养基中加入终浓度为4g/L的葡萄糖后，不同接菌量实验组对柴油降解率均有大幅度提升，结果如图3、图4、图5所示，其中SC11-32-2菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为87.56%、88.33%、88.62%；SC11-37菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为67.88%、69.12%、70.38%；菌株在107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL接种量条件下的降油率分别为75.67%、78.35%、79.56。在添加终浓度为4g/L的葡萄糖后，相同接菌量实验组3菌株相较不添加葡萄糖实验组对柴油降解率均有极显著提升（P<0.01）。而在添加终浓度为4g/L的葡萄糖的实验组，3菌株不同接菌量对柴油降解率均无显著性差异（P>0.05）。

4 讨论

通过以柴油为唯一碳源的平板培养基初筛得到3株能够利用柴油的菌株，编号为SC11-32-2，SC11-37，SC11-38，经鉴定3株菌分别属于Pseudomonas monteilii，Vibrio alginolyticus，Pseudomonas composti菌属。3株菌的原始降油率均随接菌浓度的升高而升高，其中SC11-32-2对柴油的降解率高于SC11-37和SC11-38。目前，关于Pseudomonas monteilii的报道主要是关于其胞外分泌酯酶[16]、该菌株对花草烟叶病毒的广谱抑制[17]、对硝基酚的降解作用[18]以及对植物致病菌的拮抗作用[19]，而有关该菌株对石油的降解作用还未见报道。在今后的研究中，可以通过在沙蚕养殖过程中，将降油效果优秀的SC11-32-2菌株定植到沙蚕消化道，构建降油菌的沙蚕-降油菌载体，再将其投放到石油污染土壤或滩涂中以达到原位修复的目的；也可以以SC1-32-2菌株作为优良菌源开发微生物降油菌剂。

SC11-32-2，SC11-37和SC1-38菌株在加入终浓度为4 g/L葡萄糖后对柴油的降解率均有极显著提高，可能是这3株菌存在葡萄糖与柴油的共代谢作用。微生物共代谢作用是由Jensen[20]提出，是指微生物从生长基质中获取全部或大部分的碳源和能源从而改变一些难降解的有机物的化学结构，它具有缩短微生物适应期和繁殖期的优势[21]。近年來，微生物共代谢的研究不断深入并广泛应用于污水治理、环境修复等领域难降解有机污染物的生物降解[22-24]。陈芳艳[25]等在研究外加碳源对尖镰孢菌对蒽降解的影响中发现当葡萄糖添加浓度为5 mg/L时，尖镰孢菌对蒽的降解率达到95%，显著高于其原始降解率64.8%；袁芳[26]在研究2，4-二硝基甲苯的共代谢时发现当葡萄糖与2，4-二硝基甲苯的比例达到4：1时，菌株对2，4-二硝基甲苯的降解率达到75%，显著高于其原始降解率35%。本研究中SC11-31-2，SC11-37和SC1-38菌株来自双齿围沙蚕的消化道，在添加葡萄糖时对柴油的降解率显著提高，可为今后使用菌株进行生物修复工作时提供指导和科学依据。

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收稿日期：2017-05-18

基金项目：海洋公益性行业专项项目 （ 201305002，201305043 ）

作者简介：王绪磊（1991-），男，硕士，主要研究海洋微生物在生物修复中的应用。