HSPC238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响

钟裕恒 黄 湘 梁 睿 杨海鑫 欧锦留



·基础研究·

HSPC238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响

钟裕恒 黄 湘 梁 睿 杨海鑫 欧锦留

目的 探讨高表达和干扰HSPC238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 将pcDNA3.1-HSPC238高表达和pLL3.7-HSPC238干扰载体分别瞬时转染Hela细胞，然后采用EdU增殖和Transwell侵袭实验，检测HSPC238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响。结果 与对照组相比，转染了pcDNA3.1-HSPC238质粒的Hela细胞增殖和侵袭能力下降，转染了pLL3.7-HSPC238质粒的Hela细胞增殖和侵袭能力增强，以上结果均有统计学差异(P<0.05)。结论 HSPC238高表达时能抑制Hela细胞的增殖和侵袭，干扰HSPC238时促进Hela细胞的增殖和侵袭。

HSPC238；Hela细胞；增殖；侵袭

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1045～1047)

HSPC238(又叫 RN181)，由LOC51255基因编码，含有153个氨基酸，具有E3泛素连接酶活性。我们前期实验研究发现HSPC238在CIN中低表达[1]，且随着CIN级别升高，染色程度降低，但在宫颈癌中表达未有降低[2]。那究竟HSPC238在宫颈癌中扮演着什么角色，高表达和干扰HSPC238对宫颈癌Hela细胞的增殖和侵袭能力有什么影响，将在本文中探索。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

宫颈癌Hela细胞存于本实验室，pcDNA3.1质粒，pcDNA3.1-HSPC238质粒，pLL3.7质粒，pLL3.7-HSPC238质粒由本实验室构建保存，凯基试剂盒(KGA331-50),胎牛血清(Hyclone，Hyclone SV30087.02)，DMEM-高糖培养基(GIBCO)，青链霉素(碧云天)，matrigel胶(BD公司，356234)，PBS磷酸钾缓冲液等。

1.2 细胞培养和质粒转染

将Hela细胞接种于细胞培养板，在合适条件下培养24 h。当细胞融合度达到80%时，依照LipofectamineTM2000转染试剂说明将PcDNA3.1空质粒、PcDNA3.1-HSPC238质粒、pLL3.7阴性对照载体和pLL3.7-HSPC238干扰载体分别转染至Hela细胞。然后在相同条件下培养48 h，待用。

1.3 Western blot实验

样品处理后上样，每个样本设3个复孔，GAPDH作为内参，然后电泳，转膜，加一抗(1∶500)反应1.5 h,最后加入用辣根过氧化物酶标记的相应二抗，发光显色。

1.4 EdU实验检测细胞增殖能力

Hela细胞爬片至所需的生长密度，取EDU工作液(组分A)500 μl/样，混合等体积的培养基。加入细胞爬片中，37 ℃孵育 2 h。去除培养基后加入1 ml 3.7%中性甲醇至细胞爬片上，室温孵15 min。用3%BSA洗涤细胞2次，加入1 ml 0.5%PBST每孔，室温孵育20 min，去除洗涤液。加入0.5 ml 配置好的 Click-iT反应混合液至每个孔，室温避光孵育30 min，实验重复3次。

1.5 Transwell检测细胞侵袭能力

收集对数期细胞，计数2×106/ml细胞，用无血清DMEM培养基重悬，取100 μl(1×105个)Hela细胞悬液，加入配置好的Transwell小室上室，在下室加入700 μl完全培养基。在37 ℃,5%CO2孵育72 h后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤一次，结晶紫染色10 min，检测细胞并拍照统计，实验重复3次。

2 结果

2.1 Western blot实验结果

与对照组相比，转染了pcDNA3.1-HSPC238质粒的Hela细胞其HSPC238表达增强，转染了pll3.7-HSPC238载体的Hela细胞其HSPC238表达减弱。

2.2 EdU实验结果

采用两样本t检验统计发现，与转染pcDNA3.1空质粒组(83.00±6.55)相比，转染了pcDNA3.1-HSPC238质粒的Hela细胞增殖能力降低(18.00±2.00)，P<0.05，差异有统计学意义；采用两样本t检验法统计发现，与转染pLL3.7空载体组(27.00±3.61)相比，转染了pLL3.7-HSPC238载体的Hela细胞增殖能力增强(73.33±5.51)，P<0.05，差异有统计学意义。

2.3 Transwell实验结果

图1为Transwell侵袭实验结果。采用两样本t检验法统计发现，与转染pcDNA3.1空质粒组相比(83.00±6.55)，转染了pcDNA3.1-HSPC238质粒的Hela细胞侵袭能力下降，穿过小室基底膜到达下室的细胞明显减少(18.00±2.00)，差异有统计学意义(P<0.05)；与转染pLL3.7空载体组相比(74.67±7.64)，转染了pLL3.7-HSPC238载体的Hela细胞侵袭能力增强，穿过小室基底膜到达下室的细胞明显增加(109.00±6.00)，差异有统计学意义(P<0.05)。

1为mpty组，2为pcDNA3.1组，3为pcDNA3.1-HSPC238组，4为pLL3.7组，5为pLL3.7-HSPC238组。

3 讨论

HSPC238(又叫 RN181)，由LOC51255基因编码，含有153个氨基酸，属于C3HC4型锌指蛋白。自从2008年我们课题组关注该转录因子以来，我们对HSPC238进行了系列研究，我们通过免疫组化染色发现HSPC238在肝癌中表达降低，并且能够通过MAPK途径抑制肝癌细胞的增殖和侵袭[3]。当HSPC238过表达时可以延缓肝癌细胞的细胞周期[4]，并且可以上调RB蛋白(论文正在投稿中)，进一步通过激光共聚焦，co-IP和pull down实验研究发现，HSPC238可以与四种肿瘤相关蛋白(MT2A、HO-1、RPS27A和Ubb)相互作用[5]，并且可以影响它们的mRNA和蛋白水平[6]。HSPC238不仅在肝癌中起作用，还在胃癌[7]、大肠癌[8]的生长机制中发挥调节作用。HSPC238在消化系统的多种组织中都起作用，我们想要知道它在其他系统是否起着同样的作用，所以将目光投向了高发病率的宫颈癌。

我们的前期研究发现，HSPC238蛋白在宫颈癌中并未像是在肝癌组织中那样低表达，而是在宫颈上皮内瘤变组织中表达降低。我们对这1现象很好奇，推测HSPC238在宫颈癌中的作用是否会像是TGF-β1一样[9]，在宫颈上皮内瘤变组织和宫颈癌组织中起着相反的作用，即在宫颈上皮内瘤变组织中起抑制生长，在宫颈癌中起促进生长的作用。所以本次实验研究高表达和干扰HSPC238对宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭能力的影响，我们发现高表达HSPC238能抑制Hela细胞的增殖和侵袭，干扰HSPC238可以促进Hela细胞的增殖和侵袭。本次研究结果表明高表达HSPC238并未像高表达TGF-β1一样，在宫颈癌细胞增殖和侵袭中起促进作用，而是起抑制作用。而和我们前期在肝癌中的研究对比时发现，高表达HSPC238在宫颈癌细胞和肝癌细胞中同样可以抑制细胞增殖和侵袭，但是为什么HSPC238蛋白在宫颈癌中并未像是在肝癌组织中那样低表达？通过查阅文献我们发现，1个蛋白在癌组织中高表达不一定预示它有促癌作用，如P53在很多癌组织中高表达[10]，给人们留下1个P53是促癌基因的假象，然而事实上，野生型p53是1个具有非常重要功能的抑制基因。所以HSPC238在宫颈癌中的表达量与所起的作用不是存在必然关系的，另外，由于宫颈癌和肝癌的微环境不同，在宫颈癌中高表达的HSPC238是否出现了基因突变，影响了其本该有的抑癌功能，还有待我们的进一步的探索。

[1] Brophy TM,Raab M,Daxecker H,et al.RN181,a novel ubiquitin E3 ligase that interacts with the KVGFFKR motif of platelet integrin alpha(IIb)beta3〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008,369(4):1088-1093.

[2] 钟裕恒，黄 湘，陈敬林,等.HSPC238在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达与意义〔J〕.中国免疫学杂志,2016,17(2):235-238.

[3] Wang S,Huang X,Li Y,et al.RN181 suppresses hepatocellular carcinoma growth by inhibition of the ERK/MAPK pathway〔J〕.Hepatology,2011,53(6):1932-1942.

[4] 黄 湘,谭家余,李 明,等.过表达HSPC238对Bel74- 02细胞周期的影响〔J〕.中国免疫学杂志，2011,27(2)120-125.

[5] Tan JY,Chen JL,Huang X,et al.Screening and verification of proteins that interact with HSPC238〔J〕.Oncol Rep，2015,34(6):3097-3031.

[6] 谭家余，黄 湘，陈敬林,等.HSPC238 对HMOX1、RPS- 27a、MT2A、UBB 调节的初步研究〔J〕.中国免疫学杂志，2016,13(4):509-512.

[7] 王小波.RNl81在胃癌中的表达及调节胃癌细胞增殖机制的研究〔D〕.南方医科大学，2010.

[8] 张 贤,王穗海,彭迎霞,等.构建稳定干扰RN181的RKO细胞系并研究其生长现象〔J〕.热带医学杂志，2014,14(5):698-703.

[9] Zhu H,Luo H,Shen Z,et al.Transforming growth factor-β1 in carcinogenesis,progression,and therapy in cervical cancer〔J〕.Tumour Biol，2016,37(6):7075-7083.

[10] Wang L,Yu X,Li J,et al.Prognostic significance of p53 expression in patients with esophageal cancer:a meta-analysis〔J〕.BMC Cancer，2016,16(1):373-383.

(编辑：吴小红)

The Effect of HSPC238 on the Proliferation and Invasion of Hela Cells

ZHONGYuheng,HUANGXiang,TANJiayu,etal.ChongzuoTraditionalChineseMedicalHospital,Chongzuo,532200

Objective To investigate the effect of up-regulation and down-regulation of HSPC238 on the proliferation and invasion of Hela cells.Methods PcDNA3.1-HSPC238 vector and PLL3.7-HSPC238 vector was transiently transfected into Hela cells respectively.We tested the proliferation and invasion of Hela cells by EdU proliferation assay and transwell assay.(P<0.05).Results Compared with the control group,the proliferation and invasion ability of Hela cells increased after transfected with PcDNA3.1-HSPC238 vector,decreased after transfected with PLL3.7-HSPC238 vector.Conclusion When upregulated,HSPC238 could inhibite the proliferation and invasion of Hela cells.When downregulated,it can promote the proliferation and invasion of Hela cells.

HSPC238；Hela cell；Proliferation；Invasion

国家自然科学基金(编号：81101534)；广东省医学科研基金项目(编号：A2013875)

532200 南方医科大学附属中山博爱医院

黄 湘

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.001

R737.33

A

1001-5930(2017)07-1045-03

2016-08-08

2017-05-04)