角膜交联术对酶消化抑制作用的动物实验研究

刘颖 姜黎 王江维 沈政伟

·实验研究·

角膜交联术对酶消化抑制作用的动物实验研究

刘颖 姜黎 王江维 沈政伟

目的 通过观察常规交联术后兔眼角膜组织在酶溶液中的变化，评估交联术对角膜耐酶性的影响。方法 实验研究。将27只日本大耳白兔随机分成3组(胃蛋白酶组、胰蛋白酶组、胶原蛋白酶组)，每组9只，双眼均去上皮，核黄素-右旋糖酐溶液滴眼3min/次，持续30min，滴10次。随机取一眼为实验组，另一眼为对照组，实验组兔眼用自研角膜交联机照射30min，对照组不照射，照射过程中每3min双眼都用右旋糖酐-核黄素溶液及眼表麻药冲洗1次结膜表面，之后立即处死兔子取双眼角膜，并置于配好的3种对应酶溶液中，每组随机选3只观察并记录每组角膜完全消化的时间及过程。剩下18只兔的眼角膜随机分成3组，每组6只，分别在消化的第1、3、6天随机取出两只兔子剩余的角膜组织作光镜观察(HE染色)。结果 每组角膜组织的溶解时间实验组均长于对照组，其中胰蛋白酶组有统计学意义(P<0.05)。从角膜形态变化来看，实验组发生形变的过程均慢于对照组。从光镜观察(HE染色)的结果来看实验组角膜组织发生裂解的速度亦明显慢于对照组。结论 角膜交联术能使角膜结构更加稳定、牢固，从而增强其耐酶性。

角膜交联术；酶；消化；抑制

[临床眼科杂志，2017，25：165]

[J Clin Ophthalmol,2017,25:165]

紫外光核黄素角膜胶原交联术(corneal collagen cross- linking, CXL)是近十余年来应用于临床的新型角膜成形技术。其运用的是光氧化反应原理：当光敏剂核黄素(维生素B2)在角膜基质层达到饱和状态后,在370 nm波长紫外光照射下，被激发到三线态，产生以单线态氧为主的活性氧自由基(reactive oxide species,ROS)，ROS处于不稳定状态，直到诱导角膜基质胶原纤维间形成新的共价键后才转变为稳定形式，从而使角膜生物力学增强，结构变得更加稳定、牢固。目前，CXL在临床上主要应用于圆锥角膜、术后角膜扩张等疾病的治疗，效果较好。

有研究显示CXL在某些难治性角膜溃疡的治疗方面亦取得了可喜的成果[1-3]，但其作用机制尚未完全明确，原因之一可能是交联后的角膜生物力学增强，角膜变厚、变硬，从而对酶解作用的抵抗能力增强。角膜中含有多种酶，当溃疡发生时，酶的种类及数量增多，从而促进角膜溶解[4]。本实验将从胃蛋白酶、胰蛋白酶及胶原蛋白酶这3种酶对交联后的兔眼角膜的消化情况来验证上述机制。

资料与方法

一、实验动物

7周龄清洁级日本大耳白兔27只，排除眼部及全身疾病，雌雄不限，体重2 kg左右，购于武汉万千佳兴生物科技有限公司，合格证号：No.42010000000898。实验动物的使用遵循国家科委颁布的《实验动物管理条例》。

二、实验试剂及配制

核黄素磷酸钠注射液(益然，江西制药有限责任公司)，右旋糖酐40葡萄糖注射液(四川科伦药业股份有限公司)，胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶(MDL生物科技有限公司)，生理盐水，PBS缓冲液，HCL(pH约为1.5)(广州军区武汉总医院医学实验中心提供)。

核黄素-右旋糖酐溶液，将核黄素磷酸钠注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液按1:4的比例混合均匀，现配现用；胃蛋白酶溶液，取1 g胃蛋白酶溶于10 ml HCL溶液中，现配现用；胰蛋白酶溶液，取1g胰蛋白酶溶于10ml PBS缓冲液中，现配现用；胶原蛋白酶溶液：取1 g胶原蛋白酶溶于50 ml PBS缓冲液中，分成5等份，放入-40 ℃冷冻室内储存，用之前取出室温融化。

三、实验仪器

自研角膜交联机(华中科技大学光学与电子信息学院研制)[5](图1),手术器械(广州军区武汉总医院眼科准分子激光中心提供),Leica光学显微镜(广州军区武汉总医院医学实验中心提供)。

图1 自研角膜交联机

四、方法

首先将27只日本大耳白兔按照酶的种类(胃蛋白酶、胰蛋白酶及胶原蛋白酶)随机分成3组(每组9只)，用10%水合氯醛溶液进行全身麻醉(2.5 ml/kg),待兔子麻醉后，去除双眼角膜中央直径为9 mm区域的上皮，将配好的右旋糖酐-核黄素溶液滴加到角膜表面，3 min/次，持续30 min，滴10次。随机取一眼为实验组，再用角膜交联机对实验组眼睛照射30 min(波长为370±5 nm，功率为3 mW/cm2)，照射时注意保持光源对准角膜中央，兔眼与透镜的距离在45 mm以内。在照射过程中，每3 min双眼都用右旋糖酐-核黄素溶液及眼表麻药冲洗一次结膜表面。照射结束后，立即用空气栓塞法将兔子处死取双眼角膜(胰蛋白酶组随机选3只兔的眼角膜放入沸水中加热10 min，用于观察角膜组织消化天数)，泡入配好的酶溶液中，并置于酶的最适温度，观察。除胰蛋白酶组外，胃蛋白酶组及胶原蛋白酶组也随机取3只兔的角膜不做处理，观察其形态变化直到组织被完全消化，并记录消化完成时间；每组剩余6只兔的角膜剩余组织在术后第1、3、6天各随机选2只取出切片，再进行光镜(HE染色)观察。

五、统计学方法

数据用SPSS16.0统计学软件进行分析，采用独立样本t检验对每组中实验组和对照组角膜消化时间进行数据分析，P<0.05为有统计学意义。

结 果

一、兔眼角膜组织完全消化时间

3组兔眼角膜交联术均顺利完成。胃蛋白酶组：角膜消化时间实验组分别为66d、65d、59d，平均(63.33±2.19)d；对照组分别为61d、59d、52d，平均(57.33±2.73)d，实验组长于对照组，差异无统计学意义(t=1.72,P=0.16)。胰蛋白酶组：角膜消化时间实验组分别为4d、4d、4d，平均4.00d；对照组分别为3d、3d、2d，平均为(2.67±0.33)d，实验组明显长于对照组(t=4.00,P=0.02)。胶原蛋白酶组：角膜消化时间实验组分别为7d、3d、5d，平均(5±1.15)d；对照组分别为2d、2d、2d，平均2.00d，实验组长于对照组，差异无统计学意义(t=1.73,P=0.16)(表1)。

图9 光镜下胰蛋白酶1d对照组(HE×200) 图10 光镜下胰蛋白酶3d实验组(HE×200) 图11 光镜下胰蛋白酶3d对照组(HE×200) 图12 光镜下胰蛋白酶6d实验组(HE×200) 图13 光镜下胰蛋白酶6d对照组(HE×200) 图14 光镜下胶原蛋白酶1d实验组(HE×200) 图15 光镜下胶原蛋白酶1d对照组(HE×200) 图16 光镜下胶原蛋白酶3d实验组(HE×200) 图17 光镜下胶原蛋白酶3d对照组(HE×200) 图18 光镜下胶原蛋白酶6d实验组(HE×200) 图19 光镜下胶原蛋白酶6d对照组(HE×200)

表1 各组角膜完全消化的时间(d)

二、兔眼角膜消化过程形态变化

角膜放入胃蛋白酶溶液后，在最初的十几天里逐渐皱缩、变薄，20d左右时出现裂孔，继而破裂成丝状最后消失，实验组变化均明显慢于对照组。胰蛋白酶组的角膜经沸水浴后明显肿胀，在溶液中1d即可转变为碎末状，3d左右消失，实验组的变化稍慢于对照组。胶原酶组实验组变化稍慢，在最初几天还能观察到完整角膜组织，而对照组角膜组织在酶溶液中很快裂解，然后消失。

三、兔眼角膜的光镜(HE染色)结果

胃蛋白酶组：消化1d后取出的角膜组织示，实验组角膜胶原纤维较肿胀，排列较稀疏，中外1/3层胶原染色颜色明显深于内层，细胞稍肿胀，胞核清晰可见；对照组角膜胶原纤维排列疏松，间距明显增宽，染色较均匀，细胞肿胀，未见明显细胞核。实验组较对照组胶原纤维间距明显要小，排列也更为致密(图2,3)。第3天时，实验组角膜胶原纤维肿胀较严重，细胞核形态变大，密度降低；对照组角膜胶原纤维明显肿胀，间距消失。实验组较对照组纤维排列更为致密(图4,5)。消化6d后组织染色示，与前两次比较，两组胶原纤维排列更为稀疏，胶原颜色均明显变浅，实验组较对照组深(图6,7)。

胰蛋白酶组：消化1d时，实验组及对照组组织着色较深，纤维间隙增宽，均可见胞质变性，胞核肿胀及空泡变性，对照组较实验组变化更明显，实验组炎细胞侵润更甚(图8,9)。随着观察时间变化，组织着色逐渐变浅，胶原纤维间距逐渐增宽，胞核逐渐减少，且对照组较实验组变化更为明显(图10～13)。

胶原蛋白酶组：消化1d后取出的角膜组织示，实验组胶原纤维间距明显增大，胞核清晰可见；对照组胶原纤维间距增大，但小于实验组，肿胀较实验组更重，胞核可见(图14,15)。消化3d后的角膜组织示，胶原纤维间距较之前明显增大，细胞核减少，密度降低，实验组纤维组织较对照组排列更整齐、致密(图16,17)。第6天组织示，两组染色均变浅，胶原排列稀疏(图18,19)。

讨 论

据WHO数据，角膜病已成为全球第四大致盲疾病，约占5.1%，并且其中有一部分人是可以通过角膜移植手术重获光明的。就目前我国眼库(eyebank)现状来看，角膜移植术情况不容乐观，因此找到能够阻止角膜病的进展甚至替代角膜移植术的手段就显得尤为重要。

正常人眼角膜的细胞外基质大部分为胶原纤维，当角膜发生炎症时，不仅微生物，宿主中的各种细胞也能合成和分泌多种酶类，从而对组织产生破坏，其中已经明确的有胶原酶及多种蛋白酶[6]。有研究表明，上皮能调节角膜细胞分泌胶原酶，并将角膜或多形核细胞释放的潜酶激活，同时受伤的上皮还能释放促炎性反应因子，使多形核细胞的数量变多，从而导致了角膜基质溃疡的产生[7]。胰蛋白酶能够将蛋白质分解，并且专一地从蛋白质上除去带正电荷的氨基酸，从而使组织细胞排列松散[8]，现已成为体外消化、培养角膜内皮细胞的重要试剂之一。因此本实验选择胃蛋白酶、胰蛋白酶及胶原酶来消化角膜组织。通过兔眼角膜组织被完全消化的时间可以看出经过交联后的兔眼角膜的消化时间均长于未交联角膜，且胰蛋白酶组有统计学意义，另两组可能是由于样本数量过少，后续将扩大样本量再展开进一步试验。Spoerl等[9]使用猪眼角膜分别在上述三种酶作用下，结果交联角膜在第13、14、5天时被溶解，未交联角膜分别在第6、6、2天时溶解，交联角膜溶解时间均长于对照组，这与本研究结果一致。从肉眼观察的角膜形态变化来看，对照组发生皱缩、变薄、裂孔甚至破碎的速度均较实验组更慢。

光镜结果则更为形象、明确，随着角膜组织在酶溶液中逐渐被消化，纤维间距逐渐增宽，胶原染色逐渐变浅。各组角膜组织在不同的时间点均可观察到实验组较对照组组织排列更为致密，着色也更深，说明实验组的消化速度较对照组要更慢。胃蛋白酶组在消化1天后取出的角膜组织染色示，中外1/3层颜色明显深于内层，与之前研究的交联角膜的基质层300μm处有明显分界限的结果一致[10]。这都说明交联术能增强角膜组织的生物力学特性，使其结构更加牢固稳定，从而提高了角膜抵抗酶消化作用的能力。

目前，国内外很多研究都证实交联术可增强角膜的机械强度[11]，但抗酶解力的相关研究并不多，其具体作用机制更有待进一步研究。本实验初步验证了角膜交联术对抗酶解作用的效果，后续将扩大样本量及检测方法进行更为丰富系统的研究，以期能有更多的收获，从而更加了解角膜交联术，未来能更好的为角膜病患提供帮助。

[1]KanellopoulosAJ.Novelmyopicrefractivecorrectionwithtransepithelialveryhigh-fluencecollagencross-linkingappliedinacustomizedpattern:earlyresultsofafeasibilitystudy.ClinOphthalmol,2014,8:697-702.

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[4] 李婧，姜黎，沈政伟.角膜交联术新进展及临床运用.国际眼科杂志，2010，10:1713-1715.

[5] 史明坤，胡兵，应花山，等.应用于角膜胶原交联术的紫外LED照射仪的设计.医疗卫生装备,2015，36:19-22.

[6] 李莹，谢立信.角膜理论基础及临床实践.天津：天津科技翻译出版公司，2007,246-247.

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[10]SeilerT,HafeziF.Corneacross-linking-inducedstromaldemarcationline.Cornea,2006,25:1057-1059.

[11] 李刚.核黄素-紫外线A胶原交联对角膜胶原纤维重塑及生物力学稳定性的影响.北京:军医进修学院，2012.

(收稿：2016-08-22)

Rabbit corneal tissue resistant to in vitro enzymatic digestion after corneal collagen cross-linking

LiuYing,JiangLi,WangJiangwei,ShenZhengwei.

DepartmentofOphthalmology,WuhanGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryRegion,Wuhan,Hubei430070,China

Objective To assess the effects of corneal cross-linking in rabbit cornea on its resistance to in vitro enzymatic digestion. Methods Twenty-seven Japanese white rabbits were randomly divided into three groups to be treated with different enzymes (pepsin, trypsin, collagenase). Each group had nine rabbits. Rabbit corneal epithelium was scraped. Riboflavin-dextran solution was topically administrated every three minutes for half an hour1(i.e, 10 times in total). Then one eye (randomly selected for each animal) was exposed to UV-LED irradiator for 30 minutes. Both eyes were rinsed by dextran-riboflavin and ocular surface anesthetic every 3 minutes during irradiation. Corneas were immediately taken after the rabbits were sacrificed and placed in different enzyme solutions. Time and process until the corneas had been completely digested were recorded. Another 18 Japanese white rabbits served as control. Corneal tissues were put into enzyme solutions without pre-treatment with UV-LED irradiation. Results It took more time to completely digest the cornea tissue from experimental animals, especially by Trypsin (P<0.05).Cornealdeformationoccurssignificantlyslower.Lightmicroscopyhistologyshowedthatthecleavagerateofexperimentalcornealtissuewassignificantlyslower. Conclusions Corneal cross-linking makes cornea’s structure more stable and firmer, thereby enhancing its resistance to enzymatic digestion.

Corneal collagen cross-linking; Enzyme; Digestion; Resistance

10.3969/j.issn.1006-8422.2017.02.021

武汉市科技攻关计划(No.201161038346)

430070 武汉，广州军区武汉总医院眼科

沈政伟(Email:sheneye@qq.com)