慢性胰腺炎模型胰腺组织弹性模量与病理分级的相关性

王玉涛 张建 潘桂霞 孙高峰 茅娟莉 彭晔 郑建明 俞文英 汪建华 左长京

·论著·

慢性胰腺炎模型胰腺组织弹性模量与病理分级的相关性

王玉涛 张建 潘桂霞 孙高峰 茅娟莉 彭晔 郑建明 俞文英 汪建华 左长京

目的 探讨慢性胰腺炎(CP)胰腺弹性模量与病理分级的相关性。方法 采用随机数字表法将21只小型猪分为模型组(18只)和对照组(3只)。采用不全结扎主胰管法建立CP模型，对照组不结扎胰管。术后 4、8、12 周分批处死动物，取胰腺组织行弹性模量检测及病理检查，并按照纤维化严重程度将小型猪分为对照组及轻、中、重度CP组。观察胰腺组织实质细胞密度、脂肪浸润程度、细胞外水肿程度，并进行高低或轻重分级。采用方差分析检验不同CP组间弹性模量的差异，采用Spearman等级相关检验分析弹性模量与胰腺纤维化的相关性，采用ROC曲线评估其诊断CP的效能。结果 除2只死亡外，模型组16只成功建立不同程度CP模型，其中轻度CP组7只，中度CP组2只，重度CP组7只。对照组胰腺均显示正常。对照组、轻度CP组和中-重度CP组胰腺弹性模量分别为0.4268±0.0566、0.3203±0.0518、0.2235±0.0685，组间差异有统计学意义(F=13.658，P<0.01)，且弹性模量与病理分级间呈负相关(r=0.969，P<0.01)。弹性模量鉴别正常与轻度CP的AUC为1.000，最佳临界值为0.3807，诊断敏感性、特异性均为100%；鉴别轻度与中-重度CP的AUC为0.873，最佳临界值为0.2646，敏感性为85.7%，特异性为77.8%。低实质细胞密度组、高实质细胞密度组的胰腺弹性模量分别为0.1931±0.0373、0.3485±0.0655，高密度组显著高于低密度组，差异有统计学意义(t=-5.719，P<0.01)；轻度脂肪浸润组、重度脂肪浸润组的胰腺弹性模量分别为0.3401±0.0697、0.1855±0.0344，轻度浸润组显著高于重度浸润组，差异有统计学意义(t=5.102，P<0.01)；阴性及轻度细胞外水肿组、中-重度细胞外水肿组的胰腺弹性模量分别为0.2760±0.0825、0.3024±0.1056，组间差异无统计学意义(t=0.586，P>0.05)。结论 弹性模量可以检测CP病理改变，并能评估CP病理分级。

胰腺炎，慢性； 模型，动物； 弹性模量

Fund program：Science and Technology Development program for Health & Medicine of Zhejiang province(2014KYB238); International Cooperation Foundation of Science and Technology Commission of Shanghai(10410708800); Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LY13H070008)

慢性胰腺炎(CP)可导致不可逆的胰腺形态和功能改变[1]，诊断难点在于早期、病变轻微CP的确诊。通过常规影像学及胰腺分泌功能检测诊断早期CP仍存在一定的局限性[2-3]。为此，本研究通过对CP胰腺组织样本弹性模量与病理严重程度相对照，探讨弹性模量与CP病理分级的相关性，为临床上应用弹性模量对CP分级诊断提供组织学参考依据。

材料与方法

一、实验动物及分组

健康巴马小型猪 21只，雌雄不限，月龄6～10个月，体重12.5～20.0 kg，由第二军医大学实验动物中心提供，整个实验过程中对动物的关怀符合伦理学要求。采用随机数字表法将小型猪分为模型组(18只)及对照组(3只)。模型组动物术前禁食24 h，禁水4 h。采用盐酸氯胺酮臀部肌内注射诱导麻醉，阿托品肌内注射减少呼吸道分泌物，静脉输入枸橼酸芬太尼及盐酸氯胺酮联合3%戊巴比妥维持麻醉。将小型猪仰卧固定于手术台上，上腹部备皮、消毒、铺巾后沿腹中线剑突下切口入腹，在十二指肠左缘找到胰腺头颈部，游离出主胰管。用3.0丝线将主胰管与双股3.0聚丙烯线一起结扎(聚丙烯线溶解后即为超过75%的主胰管被结扎)，同时结扎胰腺组织，以防止副胰管或侧支胰管引流胰液。对照组开腹后仅翻动胰腺及肠道，不结扎胰管。切口无菌包扎后用腹带固定。分别于造模后4、8、12周处死小型猪，取胰腺组织样本。

二、弹性模量检测

应用美国ARTANN实验室Tissue Elastometer(型号TE-v2.0)弹力检测仪检测胰腺组织弹性模量。Tissue Elastometer包括电子天平、线性致动器和笔记本电脑。电子天平作为放置组织样本的对象板和检测过程中力测量的装置，分辨率为0.1 mN，组织样本最大重量为200 g；线性致动器垂直驱动一个圆柱形压头对组织样本进行压缩测试，压头的直径为3.0 mm，垂直位移范围为0～3.2 cm，线性速度为0.05～0.1 mm/s；笔记本电脑内有一个图形用户界面和操作软件。

取胰腺体尾部部分组织，每块组织块高度为12～20 mm，长度及宽度为20～40 mm，行3次弹性模量检测，取均值作为胰腺组织的弹性模量。

三、胰腺组织病理学检查

剩余的胰腺标本用甲醛固定后常规制作石蜡切片，行HE染色及Van Gieson(VG)染色后，由2名高年资病理科医师盲法读片，并按照胰腺纤维化增生程度、腺泡萎缩破坏和炎细胞浸润程度将CP分为轻、中、重度3级[4]。(1)轻度CP：胰腺腺泡基本正常，轻微纤维化，即纤维化主要分布于小叶周围，小叶内不受累，可见淋巴细胞、浆细胞和少量巨噬细胞浸润；(2)中度CP：腺泡萎缩、破坏伴间质纤维化，纤维化增生从小叶周围扩展到小叶内、腺泡间，间质内可见较多淋巴细胞、浆细胞浸润；(3)重度CP：小叶周围和小叶内纤维化相互融合形成较大范围网格状纤维化，胰腺腺泡几乎完全被破坏，间质内仍可见淋巴细胞、浆细胞浸润，但浸润的细胞数量较中度减少。此外，观察胰腺组织实质细胞密度(包括内、外分泌细胞)、脂肪浸润程度、细胞外水肿程度，并参照文献[5]进行高低或轻重分级。

四、统计学处理

结 果

一、CP模型制备成功率及分级

剔除病理改变不明显或术后感染发生死亡的2只外，模型组16只成功建立不同程度CP模型，其中轻度CP 7只，中度CP 2只，重度CP 7只。对照组3只小型猪的胰腺组织未见异常改变。

二、各组小型猪胰腺的弹性模量

对照组及轻、中-重度CP组胰腺的弹性模量分别为0.4268±0.0566、0.3203±0.0518、0.2235±0.0685，组间差异有统计学意义(F=13.658，P<0.01)。胰腺组织弹性模量随CP病理严重程度增加而降低，两者呈负相关(r=0.969，P<0.01)。对照组与轻度CP组间，轻度CP 组与中-重度CP组间的差异也均有统计学意义(t=2.913，P<0.05；t=3.106，P<0.01)。

三、弹性模量诊断CP的效能

弹性模量鉴别正常与轻度CP的AUC为1.000，最佳临界值为0.3807，诊断敏感性为100%，特异性为100%，阳性预测值100%，阴性预测值100%，约登指数1；鉴别轻度与中-重度CP的AUC为0.873，最佳临界值为0.2646，敏感性为85.7%，特异性为77.8%，阳性预测值87.5%，阴性预测值75.0%，约登指数0.635(图1)。

图1 弹性模量鉴别轻度CP与中-重度CP的ROC曲线

四、其他观察指标

7只小型猪胰腺为低实质细胞密度，12只胰腺为高实质细胞密度，它们的胰腺弹性模量分别为0.1931±0.0373、0.3485±0.0655，高密度组显著高于低密度组，差异有统计学意义(t=-5.719，P<0.01)；13只小型猪胰腺轻度脂肪浸润，6只胰腺重度脂肪浸润，它们的胰腺弹性模量分别为0.3401±0.0697、0.1855±0.0344，轻度浸润组显著高于重度浸润组，差异有统计学意义(t=5.102，P<0.01)；8只小型猪胰腺阴性或轻度细胞外水肿，11只胰腺中-重度细胞外水肿，它们的胰腺弹性模量分别为0.2760±0.0825、0.3024±0.1056，中-重度水肿组略高于阴性或轻度水肿组，差异无统计学意义(t=-0.586，P=0.566)。

讨 论

病理学诊断是CP诊断的确定标准，但临床工作中不易获得早期CP(或称为疑似CP)患者的胰腺样本。CP诊治指南[1]不推荐常规使用胰腺活组织检查，且该检查受技术条件限制，很难反应CP组织的整体状况，有一定并发症的风险[6]。小型猪阻塞性CP的发病机制、理化指标、大体形态及影像学表现均与人类十分相近[4,7-8]。因此，应用小型猪CP模型作为研究平台可弥补临床研究的限制和不足。

胰腺实质纤维化是CP典型的病理组织学特征之一[8]，是一种主动进行的病理损害过程，可导致胰腺实质硬度增加。生物组织的弹性或者硬度在很大程度上依赖于组织分子以及这些分子结构在微观、宏观上的组织形式。弹性模量是物体弹性变形程度的表征，宏观上是衡量物体抵抗弹性变形能力大小的尺度，微观上则是原子、离子或分子之间键合强度的反映[9]。组织的弹性模量变化与异常的病理状态相关，不同的组织以及同一组织的不同病理状态之间弹性或硬度存在差异。

本研究结果显示，正常组、轻度CP组与中-重度CP组间弹性模量差异均有统计学意义，且随着CP胰腺组织纤维化程度加重而下降，呈负相关。应用弹性模量鉴别轻度CP与正常胰腺的敏感性、特异性均达100%，鉴别轻度与中-重度CP的敏感高达85.7%，特异性高达77.8%，表明弹性模量不仅可以用于早期发现CP，并且有助于判断CP 纤维化的严重程度。

本研究结果还显示，轻度脂肪浸润组和重度脂肪浸润组、低实质细胞密度组和高实质细胞密度组间弹性模量差异均有统计学意义；阴性或轻度细胞外水肿组、中-重度细胞外水肿组间弹性模量的差异无统计学意义，提示胰腺组织弹性模量与脂肪浸润程度、实质细胞密度相关，而与细胞外水肿程度无明显相关性。Sugimoto等[10]的研究结果显示，弹性模量与胰腺脂肪比例无相关性。纤维化、脂肪浸润、细胞密度和水肿均认为是影响胰腺组织弹性的组织学因素。纤维化对胰腺组织弹性模量的影响明显高于脂肪浸润，也可能掩盖了脂肪浸润引起的弹性变化[5]。此外，研究结果的差异也可能与抽样误差有关。

由于条件所限，本研究的标本量较少，另外活体和体外实验是否存在差异、胰腺不同状态下的结果是否存在差异等，都需要进一步深入研究。

[1] 中华医学会外科学分会胰腺外科学组. 慢性胰腺炎诊治指南(2014版)[J]. 中华外科杂志, 2015, 53(4): 241-246. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0529-5815.2015.04.001.

[2] Perez-Johnston R, Sainani NI, Sahani DV. Imaging of chronic pancreatitis (including groove and autoimmune pancreatitis)[J]. Radiol Clin North Am, 2012, 50(3): 447-466. DOI: 10.1016/j.rcl.2012.03.005.

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[4] 汪建华, 张建, 孙高峰, 等. 慢性胰腺炎模型胰泌素刺激动态MR胰胆管成像表现及与病理程度分级的相关性[J]. 中华放射学杂志, 2015, 49(9): 698-703. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1005-1201.2015.09.013.

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[7] 汪建华, 张建, 孙高峰, 等. 小型猪不同程度阻塞性慢性胰腺炎模型建立及其CT表现[J]. 中华胰腺病杂志, 2012, 12 (6): 403-405. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.06.013.

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[10] Sugimoto M, Takahashi S, Kojima M, et al. What is the nature of pancreatic consistency? Assessment of the elastic modulus of the pancreas and comparison with tactile sensation, histology, and occurrence of postoperative pancreatic fistula after pancreaticoduodenectomy[J]. Surgery, 2014, 156(5): 1204-1211. DOI: 10.1016/j.surg.2014.05.015 .

(本文编辑：屠振兴)

Correlation of tissue elasticity modulus and pathological grades in a chronic pancreatitis model

WangYutao,ZhangJian,PanGuixia,SunGaofeng,MaoJuanli,PengYe,ZhengJianming,YuWenying,WangJianhua,ZuoChangjing.

DepartmentofRadiology,AffiliatedHospital,MedicalSchool,NingboUniversity,Ningbo315020,China

WangJianhua,Email:woxingw@sina.com;ZuoChangjing,Email:changjing.zuo@qq.com

Objective To investigate the correlativity between elasticity modulus and pathological severity in chronic pancreatitis (CP). Methods Twenty-one pigs were divided randomly into experimental group (n=18) and control group (n=3) using random number method. The main pancreatic duct (MPD) was incompletely ligated to establish the CP model. In control group, MPD was not ligated. The animals were killed in batches at 4th, 8th and 12th week after surgery. The pancreatic tissue was taken for elasticity modulus test and pathological examination, and the pigs were classified into control, mild, moderate and severe groups based on the severity of fibrosis. Cell density, fat infiltration and extracellular edema were observed and classified into mild and severe. The difference of elasticity modulus among different groups were compared by Variance analysis, the correlation between pancreatic fibrosis and elastic modulus was analyzed with Spearman correlation analysis, and ROC curve was used to evaluate its efficacy of diagnosing CP.Results Sixteen CP models were established successfully expected for 2 deaths (mild,n=7; moderate,n=2 and severe,n=7). All of the control group (n=3) showed normal pancreas. The elasticity modulus of control, mild and moderate to severe group were 0.4268±0.0566, 0.3203±0.0518 and 0.2235±0.0685, respectively. The difference between the groups was statistically significant (F=13.658,P<0.01), and the elastic modulus and pathological grade had a negative correlation (r=0.969,P<0.01). AUC of elasticity modulus for differentiating normal and mild CP was 1.000, the best critical value was 0.3807, and both the sensitivity and specificity of the diagnosis were 100%. AUC for differentiating mild and moderate to severe CP was 0.8730, the best critical value was 0.2646, and the sensitivity and specificity of the diagnosis were 85.7% and 77.8%, respectively. The pancreatic elasticity modulus of low parenchymal cell density group and high parenchymal cell density group were 0.1931±0.0373 and 0.3485±0.0655, respectively, which in the high cell density group was significantly higher than that in the low cell density group (t=-5.719,P<0.01). The elasticity modulus of negative infiltration or slight fatty infiltration group and severe fatty infiltration group were 0.3401±0.0697 and 0.1855±0.0344, respectively, which in the negative infiltration or slight infiltration group was significantly higher than that in severe infiltration group (t=5.102,P<0.01). The elasticity modulus of negative or mild cell edema group and moderate to severe cell edema group were 0.2760±0.0825 and 0.3024±0.1056, respectively; there was no statistically significant(t=-0.586,P>0.05). Conclusions The elasticity modulus can be used to detect the pathological changes of CP, and evaluate the CP pathologic grades.

Pancreatitis，chronic； Models，animal； Elasticity modulus

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.03.002

315020 宁波，宁波大学医学院附属医院影像科(王玉涛、汪建华)；第二军医大学长海医院核医学科(张建、潘桂霞、孙高峰、茅娟莉、彭晔、左长京)，长海医院病理科(郑建明)；宁波市临床病理诊断中心病理一科(俞文英)

共同第一作者：张建

汪建华，Email: woxingw@sina.com；左长京，Email: changjing.zuo@qq.com

浙江省医药卫生科技计划项目(2014KYB238)；上海市国际科技合作基金(10410708800)；浙江省自然科学基金(LY13H070008)

2017-01-12)