佛手的1H-NMR指纹图谱研究

黄兰平,靳丽萍,谢佳妮,张应烙

(浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华 321004)



佛手的1H-NMR指纹图谱研究

黄兰平,靳丽萍,谢佳妮,张应烙*

(浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华 321004)

建立佛手的氢核磁共振(1H-NMR)指纹图谱,为判别不同来源的佛手药材及其质量提供依据。利用核磁共振仪测定不同产地的佛手,对NMR数据分别进行相似度法、聚类分析和主成分分析法评价。结果表明:金佛手和川佛手的相关系数均在0.95以上,而与广佛手的相似度较低,相关系数均在0.86以下;金佛手和川佛手中的柠檬内酯相对含量要比广佛手多;聚类分析结果也说明广佛手与金佛手及川佛手能够明显分开,而金佛手与川佛手比较相似;主成分分析得到四个主成分,其累计贡献率达到95.352%。该方法可以快速简便地区分不同品种的佛手,可为佛手的质量控制及使用提供参考。

1H-NMR指纹图谱,佛手,聚类分析,主成分分析

佛手(CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle),别名枸橼、枸橼子、香泡,属于芸香科柑橘属植物,主要分布于热带和亚热带,我国浙江、江西、福建、广东、广西、四川、云南等地均有栽培[1]。根据出产地不同,佛手可分为多个品种:产于广东、广西的药用佛手称为“广佛手”,产于浙江金华的称“金佛手”,产于四川等地称“川佛手”。佛手具有较高食用和药用价值,药理实验表明其具有止咳平喘、改善心血管系统、免疫调节和抗肿瘤等作用[2-3],在临床上广佛手、川佛手和金佛手均可入药,然而大量研究结果表明,不同产区、品种的佛手化学成分差异明显[4-7],会影响临床疗效[2]。

随着氢核磁共振技术(Proton nuclear magnetic resonance,1H-NMR)发展,1H-NMR灵敏度逐步提高,核磁技术也随之用于药物分析中,且该法已被收载于2010 年版《中国药典》附录中[8]。1H-NMR指纹谱与传统HPLC指纹谱相比,可以直接提供结构信息,无需标准品,无须复杂前处理和预分离[9-10]。本文通过建立佛手的氢核磁共振(1H-NMR)指纹图谱,为判别不同来源的佛手药材及其质量提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蒸馏水,95%乙醇 分析纯,北京化工厂;DMSO-d6Cambridge Isotope公司;不同产地的佛手 广东肇庆(A)、广西桂林(B)、金华赤松镇(C)、金华罗店镇(D)、四川乐山(E)、四川芦山(F)、重庆江津(G)。

Bruker AVANCE Ⅲ 600型超导傅立叶变换NMR谱仪 瑞士Bruker公司;AS7240B型超声器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司;BSl24S型1/1万电子天平 德国Sartorius;RZ-52B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 供试样品溶液的配制

供试样品干佛手粉碎后过60目筛,精密称取佛手样品粉末8 g,加95%乙醇300 mL进行超声提取2次。每次1 h,合并提取液后过滤得滤液,用旋转蒸发仪旋干溶剂得粗浸膏,45 ℃烘箱烘干粗浸膏减少溶剂乙醇的影响。取20 mg上述粗浸膏,溶解于0.5 mL DMSO-d6中。

1.31H-NMR测试条件

采用zg30脉冲序列采集1.2制备的供试样品溶液的1H-NMR图谱。测定温度298 K,观测频率600.13 MHz,谱宽5101.1 Hz,采样数据点65536,扫描次数4次,TMS为内标。

1.41H-NMR图谱处理

分段积分法:应用MetresNova软件进行分段积分,选择δ0.70～8.14范围的1H-NMR图并以每δ0.04 作为1个单位进行分段积分,得到各化学位移段与之相对应的信号峰面积值,以ASCII格式输出数据。本实验共获得180段积分(扣除水峰信号δ3. 26～3. 34、DMSO溶剂峰信号δ2.50～2.54和提取溶剂乙醇残留峰信号δ1.02～1.10及δ3.54～3.58)。将获得的数据矩阵(180个变量× 7个样品),根据相似度计算原理,利用Excel 2007软件进行相似度分析,导入SPSS软件进行聚类分析。

共有峰积分法:选取图1中不重叠的18个质子信号峰作为共有峰,计算积分面积,获得共有峰面积值,导入SPSS软件进行主成分分析(PCA)。

1.5 方法学考察

1.5.1 精密度实验 取同一份佛手供试样品溶液,在上述1H-NMR按1.3项测试条件下连续6次测定指纹图谱,用MetresNova软件处理图谱,采用1.4项下的积分方法得到一系列相对峰面积积分值。计算6组数据之间的相关系数,分析仪器精密度。

1.5.2 重复性实验 按1.2项方法下配制同一批次佛手供试样品溶液6份,按1.3项下条件测试1H-NMR指纹图谱,用1.4项下方法处理图谱,计算6组数据相对峰面积积分值之间的相关系数,考察其重复性情况。

1.5.3 稳定性实验 取同一份佛手供试样品溶液,分别在0、1、2、3、4、5 d按1.3项下条件测试1H-NMR指纹图谱,用1.4项下计算6组数据相对峰面积积分值之间的相关系数。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

精密度实验中分段积分法计算相差系数结果均在0.99以上,表明仪器是精准的。重复性实验中相关系数计算结果均在0.99以上,表明该方法的重复性良好。稳定性实验中相关系数计算结果均在0.99以上,表明供试样品溶液在6 d内稳定。

2.21H-NMR指纹图谱

通过MetresNova软件处理图谱后得到7批佛手样品的1H-NMR指纹图谱(图1)。通过直观分析,可以看到广佛手(广东肇庆、广西桂林)、金佛手(金华赤松镇、金华罗店镇)、川佛手(四川乐山、四川芦山、重庆江津)3个不同品种佛手提取物1H-NMR在大部分场区的轮廓大致相同,均含有黄酮类、糖类、有机酸类和脂肪酸类成分。但在部分场区仍有一定差异,例如在高场区(δ0.5～1.5,扣除δ1.1左右的乙醇残留三重峰),广佛手与川佛手有一定的差别,表明它们的有机酸及脂肪酸类等成分有差别;在δ3.3～3.6的区域中,不同基原的一些信号峰的强度存在着一定差异,广佛手在该区域中的信号峰强度明显弱于其他2个品种,表明3个基原品种间的化学成分含量有一定的差异。

图1 7批不同来源佛手样品溶液的典型1H-NMR指纹图谱及其δ7.5～8.5局部放大图Fig. 1 1H-NMR fingerprint of 7 batches sample solution of C. medica from different origins and partial enlarged detail between δ7.5～8.5注:A. 广东肇庆;B. 广西桂林;C. 金华赤松镇;D. 金华罗店镇;E. 四川乐山;F. 四川芦山;G. 重庆江津;H. 柠檬内酯。

已有研究表明柠檬内酯(又称柠檬油素)(分子结构式见图2)在佛手药材中含量较高,是金佛手、广佛手和川佛手中的一个主要的次级代谢产物,并且现代药理实验证明柠檬内酯为佛手药材的主要有效成分之一[7],所以可将柠檬内酯作为佛手药材质量评价的指标之一,本实验从金佛手提取物中分离出该化合物,其氢谱图参见图1,具体的氢谱数据如下:1H-NMR(DMSO-d6,600.13 MHz)δ:8.02(1H,d,J=9.7 Hz,H-4),6.53(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.20(1H,d,J=9.7 Hz,H-3),6.62(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),3.87和3.91(各3H,s,OCH3×2),其波谱数据与文献[11]基本一致,可以鉴定该化合物为5,7-二甲基香豆素(柠檬内酯)。在1H-NMR中,共振峰面积或峰高与产生该共振峰的质子数成正比,这是定量的依据,可利用特征峰相对含量法对成分的含量进行宏观分析[9]。在柠檬内酯氢谱中,化合物H-4(δ8.02)峰达到基线分离且两侧基线平坦(参见图1),不受其它信号干扰,符合定量原则,因此,选定δ8.02峰为柠檬内酯相对含量的定量峰,从图中可直观看出金佛手和川佛手中的柠檬内酯相对含量要比广佛手多,与崔红花等[7]报道的佛手柠檬内酯含量结果稍有出入,可能与我们采用不同的提取溶剂有关。

表1 7批佛手的来源产地和相似度评价结果Table 1 Geographical source and the similarity of 7 batches raw materials of Citrus medica L.var. sarcodactylis Swingle

图2 柠檬内酯的分子结构式.Fig.2 Molecular structure of limettin

2.3 统计分析

2.3.1 相似度评价 7批不同来源的佛手药材按照1.2项下的方法制备成供试样品溶液,采用1.3项下的条件测试上面样品的1H-NMR,采用分段积分法进行处理1H-NMR指纹图谱,对获得的NMR积分面积数据矩阵进行相似度计算。选择金华赤松镇佛手的图谱作为对照指纹图谱,计算7批样品的相关系数值,结果显示金华赤松镇佛手与金华罗店镇佛手及3个川佛手的相关系数均在0.9537～0.9981间(见表1),而金华赤松镇佛手与2个广佛手的相似度较低,相似度为0.7969、0.8580,提示金佛手与川佛手的化学成分非常相似,而金佛手与广佛手的化学成分存在一定差异。

2.3.2 聚类分析 采用分段积分法,以不同产地佛手药材的1H-NMR峰面积积分值归一化后为原始数据,SPSS 19.0软件对相关数据进行系统聚类分析,采用组间平均数联结法,以夹角余弦为样品相似度的距离公式,聚类分析结果见图3。由图可知,佛手药材被分为2大类,一类包括广佛手A(广东肇庆)和B(广西桂林);另外一类包括金佛手C(金华赤松镇)、D(金华罗店镇)和川佛手E(四川乐山)、F(四川芦山)、G(重庆江津)。因此,通过聚类分析得到的各产地佛手之间的相关性与相似度分析的结果一致,它们之间相互验证。

图3 聚类分析树状图Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

2.3.31H-NMR共有峰主成分分析 主成分分析法是一种应用广泛的多元统计方法,用于简化数据,快速实现模式或关系的可视化识别。SPSS19.0软件对原始数据进行标准化处理,以主成分的特征值及贡献率为依据,对7个不同产地佛手药材的18个共有峰进行主成分分析,结果见表2和表3。

表2 抽取的主成分特征值及贡献率Table 2 The characteristic value and contribution of principal components

由表2可知,主成分个数的提取原则为其对应的特征值大于1,故取前4个作为主成分,其累计贡献率达到95.352%,它代表了所研究谱峰的95.352%的信息量。其中,第一主成分特征值为9.503,贡献率为52.793%,是佛手药材最重要的成分群。由表3可以看出,第1主成分因子与3～5、13、16～17号特征峰高度正相关,提示δ2.870～2.910、δ3.000～3.050、δ3.050～3.090、δ4.250～4.290、δ6.200～6.260、δ6.570～6.630这六个积分段峰对不同样品的区分评价贡献较大;第2主成分因子与18号特征峰高度正相关,说明第2主成分反映的主要是δ8.000～8.030峰的信息,即第2主成分主要反映柠檬内酯H-4峰的信息;第3和第4主成分因子分别与7号和6号特征峰高度正相关,提示它们分别反映δ3.240～3.260和δ3.090～3.140峰的信息。上述高度正相关的特征峰在佛手药材的质量控制中有相对重要的作用,除了δ8.000～8.030峰已明确为柠檬内酯H-4峰外,其它特征峰属于何种化合物有待于进一步的研究分析。

表3 主成分因子载荷矩阵Table 3 Loading matrix of principal component factor

综上所述,运用聚类分析和主成分分析,可实现快速分析,发挥各自优势,互相验证和补充,从多角度综合评判佛手药材的质量。

3 讨论

建立全面、系统、特征性的指纹图谱,是佛手质量评价的有效办法。关于佛手药材的HPLC指纹图谱已有报道[12-13],但尚未见1H-NMR指纹图谱研究。本实验建立了不同产地佛手药材1H-NMR指纹图谱。通过相似度计算、聚类分析和主成分分析,对药材进行综合评价,得到较理想的结果。同时,本实验还进行了1H-NMR指纹谱方法学考察,发现精密度、稳定性、重复性都符合指纹图谱的要求,为佛手药材的质量控制提供了更全面的参考。

本实验只表征了佛手粗提取氢谱中的一个主要次级代谢产物柠檬内酯,至于粗提取氢谱中的其它化合物表征及质量控制的关键成分确定,还有待于进一步的研究探讨。

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Study on1H-NMR fingerprinting ofCitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle

HUANG Lan-ping,JIN Li-ping,XIE Jia-ni,ZHANG Ying-lao*

(College of Chemistry and Life Science,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,China)

To provide the base for distinguishingCitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle from different regions and quality evaluation,the1H-NMR fingerprint analysis ofC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle was established. The samples collected from diverse geographical locations were determined by the1H-NMR method. The NMR data was evaluated by the methods of similarity analysis,cluster analysis and principal component analysis. The experimental results showed that the similarity value was above 0.95 betweenC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua andC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Sichuan. However,the similarity value was with under 0.86 betweenC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua andC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Guangdong. The relative component of limettin inC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua and Sichuan were greater than that ofC.medicaL. Var.sarcodactylisSwingle from Guangdong. The result of cluster analysis also showedC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Guangdong was different from theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua and Sichuan,but theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Jinhua was similar to theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle from Sichuan. According to the principal components analysis,four principal components was obtained,and the contribution rate of accumulative total of variance of the four factors was 95.352%.The established method was a quick,simple and useful for distinguishing different species and assessment of the quality of theC.medicaL. var.sarcodactylisSwingle.

1H-NMR;CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle;cluster analysis;principal component analysis

2016-12-08

黄兰平(1996-),女,本科,主要从事天然药物化学研究,E-mail:1239048674@qq.com。

国家自然科学基金资助项目(21002092);浙江省自然科学基金(LY17C010002);金华市科学技术研究计划项目(2014-2-049)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)11-0291-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.047