产广谱乳酸菌素乳酸菌的选育

赵耀+李玲+刘飞扬+罗思芹+曹珂珂

摘 要：该研究从自然界中筛选出产广谱乳酸菌素的乳酸菌，利用单层琼脂平板打孔抑菌法筛选。所筛选的产细菌素C1菌株鉴定为乳球菌属（Lactococcus），排除有机酸和过氧化氢等干扰后，发酵上清液仍有较强的抑菌性质；用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，发酵上清液的抑菌性急剧下降，证明该乳酸菌素具有蛋白质性质，是一种乳酸菌细菌素。体外抑菌实验表明，该乳酸菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用，具有广谱抑菌性。

关键词：乳酸菌素；乳酸菌；选育；鉴定

中图分类号 Q935 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）11-0052-03

Screening for Lactic Acid Bacteria Producing Broad-spectrum Bacteriocin

Zhao Yao et al.

（College of Food and Biological Engineering，Bengbu University，Bengbu 23030，China）

Abstract：To screen the lactic acid bacteria produced by the broad spectrum lactic acid bacteria from nature，single layer agar plate pore inhibition method was used. The bacteriocin-isolated bacteriocin-C1 strain was identified as Lactococcus，the excretion of organic acids and hydrogen peroxide，and the fermentation broth still had strong antibacterial properties. After treatment with pepsin and trypsin，the bacteriostasis of the liquid decreased sharply，which proved that the lactic acid bacteriumhad the protein property and were lactic acid bacterium. In vitro antibacterial experiments showed that thelactic acid bacteria on Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria had antibacterial effect，with broad-spectrum antimicrobial.

Key words：Bacteriocin；Lactic acid bacteria；Breeding；Identification

乳酸菌形态各异，在食品、药品等行业都有着广泛的应用[1-2]。乳酸菌可以產生有机酸、过氧化氢和乳酸菌素等物质，其中乳酸菌素发挥着重要的作用，它可以抑制啤酒腐败、延长食品保藏时间，同时在临床上用于治疗腹胀、腹泻、胃炎等症，改善肠道环境。乳酸菌素作为生物防腐剂，因其具有高效、无毒、无残留、无抗药性等诸多优点，引起了广大从事菌种研究领域人员的热议，具有广阔的应用前景[2-6]。本实验从泡菜中经过大量的筛选，获得一株C1菌株，该菌株产生的乳酸菌素具有广谱抑菌效果，经过排酸实验和排过氧化氢实验后仍有很强的抑菌性，用胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后抑菌性大幅度降低，说明其抑菌物质是细菌素。体外抑菌实验表明，该细菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制效果，对酵母菌和霉菌无抑制效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源材料 泡菜、酸奶。指示菌：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、产气杆菌、啤酒酵母、黑曲霉、毛霉。

1.1.2 培养基 MRS培养基（上海星科生物科技有限公司）、PYG培养基（江苏菲亚生物科技有限公司）、牛肉膏蛋白胨培养基（北京鸿润宝顺科技有限公司）。

1.1.3 主要仪器 BHC-1300生物洁净安全柜、JW-3021H高速离心机、XMT-A700恒温培养箱、DY04-13-44-00台式压力蒸汽灭菌器、BC-50S美菱冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的富集与分离 将泡菜、酸奶加入锥形瓶中，恒温培养箱中37℃培养48h。富集液10倍递增稀释，取10-5、10-6、10-7稀释液各300μL，涂布于含有碳酸钙的MRS平板上培养，挑取溶钙圈较大的菌落在MRS平板上划线分离，选取菌落大小、颜色、形状均一致、革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性菌株，备用。

1.2.2 产乳酸菌素乳酸菌的初筛 将分离到的乳酸菌菌株接种到MRS液体培养基中，37℃培养24h，4℃，6000r/min，离心15min，取上清液备用。将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌悬液10倍梯度稀释涂指示菌平板。采用单层琼脂平板打孔法进行抑菌实验[7]，用直径6mm打孔器在指示菌平板上均匀打出4个孔，取0.1mL发酵上清液注入小孔中，室温下静置4h后，37℃培养12h，测量抑菌圈直径。

1.2.3 产乳酸菌素乳酸菌的复筛[8] （1）酸排除实验：取pH4.5作为乳酸抑制作用的最小pH，调节初筛菌株的发酵上清液pH至4.5，以相应pH值的空白培养基为对照，进行抑菌实验。（2）过氧化氢排除实验：挑取排除酸作用后仍具有较强抑菌效果的菌株，将其发酵上清液于80℃加热10min后，进行抑菌实验。（3）蛋白酶敏感性实验：挑取排除酸、过氧化氢干扰后，抑菌活性最强的菌株进行蛋白酶敏感性实验，调节菌株pH为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶作用的最适pH值7.0，按终浓度为1mg/mL加入各酶，37℃温育2h，将pH值调到4.5后进行抑菌实验。

1.2.4 菌株鉴定[9] （1）个体形态和菌落特征，进行菌株革兰氏染色、个体形态、菌落形态的培养与观察。（2）理化性质鉴定，对菌株进行过氧化氢酶实验、伏谱实验、吲哚实验、甲基红实验、葡萄糖产气实验、氧利用实验、葡聚糖产生实验、运动性检测、牛奶实验、糖发酵实验和生长条件测定等实验。

1.2.5 体外抑菌实验 对大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、毛霉和黑曲霉进行单层平板打孔抑菌实验，真菌25℃，细菌30℃培养，测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的富集与分离 从富集液中分离9株菌株，实验证明，这9株菌都是革兰氏阳性菌，过氧化氢酶接触阴性，符合乳酸菌的标准。

2.2 产广谱乳酸菌素乳酸菌的初筛 9株乳酸菌中有A2、C1、C3 3株菌株出现较大抑菌圈，如表1所示，筛选出的3株乳酸菌上清液对于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均有抑菌效果，所筛乳酸菌上清液既抑制革兰氏阳性菌，也抑制革兰氏阴性菌。

2.3 产广谱乳酸菌素乳酸菌的复筛

2.3.1 排酸实验 乳酸菌对其他菌株产生的抑菌效果可能是自身代谢产生的有机酸产生的效果，也可能是代谢生成的乳酸菌素产生的效果，调节筛选的菌株发酵液的pH为4.5，进行抑菌实验，如表2所示，对照组（pH为4.5的MRS空白培养基）的抑菌圈直径比其他两组小，说明这2组乳酸菌产生的代谢产物中排除有机酸后仍有其他抑菌物质[10]。

2.3.2 过氧化氢排除实验 乳酸菌在自身代谢过程中也会产生过氧化氢，过氧化氢也可能抑制其他微生物的生长[11]，所以为排除其干扰，上述两组发酵上清液经过80℃水浴加热10min，将发酵液中的过氧化氢充分分解，冷却至常温后进行抑菌实验，同时以发酵上清液原液作为对照组。抑菌结果显示（如表3），C1、C3菌株的抑菌圈直径与排酸实验大小几乎相同，排除过氧化氢干扰后，这两个菌株仍然有抑菌作用，说明C1、C3菌株产生的抑菌效果是由其他抑菌物质产生。

2.3.3 蛋白酶敏感性实验 选出抑菌效果最强的C1菌株进行蛋白酶敏感性实验，同时以发酵上清液原液作为对照组。由表4可知，乳酸菌C1的发酵上清液经过酶处理后，对2种指示菌的抑菌效果明显降低，说明此发酵上清液中的抑菌物质是一种蛋白质，该抑菌物质为细菌素[12]。

2.4 产广谱乳酸菌素乳酸菌的分类与鉴定

2.4.1 乳酸菌C1的形态 筛选的菌株其菌体细胞呈球状，单个或成对存在，革兰氏染色呈阳性，无芽孢。菌落表面光滑，边缘整齐，乳白色不透明[13]。

2.4.2 乳酸菌C1的理化性质 该乳酸菌经过一系列的理化性质实验，过氧化氢酶实验、伏谱实验、吲哚实验、葡萄糖产气实验和运动性实验均为阴性，糖发酵实验中，蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖均为红色，肌醇淡黄色。C1菌株在温度条件实验中，10℃下生长迟缓，35℃下生长状况良好，45℃不生长；C1菌株在耐盐实验中，NaCl浓度为2%、4%的环境下可以生长，6.5%浓度下不生长；C1菌株在酸碱环境实验中，pH在4.3和6.8时生长，在9.5时不生长。根据上述形态观察、理化性质实验、糖发酵实验和菌种生长条件实验结果，再根据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[14]和《常见细菌系统鉴定手册》[15]，初步确定C1菌株为乳球菌属（Lactococcus）。

2.5 体外抑菌实验 由表5可知，C1菌株上清液对大肠杆菌、单增李斯特氏菌、枯草芽孢杆菌、产气肠杆菌均有抑菌效果，说明C1菌株对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有抑制作用；但该上清发酵液对酵母菌和霉菌无抑制作用。所以C1菌株代谢产生的乳酸菌素具有一定的广谱抑菌性。

3 结论

本实验从泡菜中选出9株乳酸菌，这些菌落都为乳白色或者浅黄色、湿润、光滑、菌落突起、边缘整齐，而且革兰氏染色阳性、过氧化氢实验为阴性。菌落四周的溶钙圈较大，都符合乳酸菌的特性。

9株乳酸菌中有A2、C1、C33株菌株在单层琼脂平板打孔抑菌实验中产生抑菌圈。然后进行复筛，在排除有机酸和排过氧化氢因素影响后，对抑菌效果较好的C1菌株进行蛋白酶敏感性实验，用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，发酵上清液的抑菌性急剧下降，证明该乳酸菌素具有蛋白质性质，根据细菌素的定义可知，C1菌株的抑菌物质是乳酸菌细菌素。菌株理化性质初步鉴定C1菌株为乳球菌属（Lactococcus）。

经过体外抑菌实验确定C1菌株产生的乳酸菌素对革兰氏阳性菌（单增李斯特氏菌等）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌等）均有抑制作用，对毛霉和黑曲霉并无明显抑制作用，具有广谱抑菌性。

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[16]Eun-Seo Lim.Inhibitory effect of bacteriocin-producing lactic acid bacteria against histamine-forming bacteria isolated from Myeolchi-jeot[J].Fisheries and Aquatic Sciences，2016，19：1-10. （责编：张宏民）