超高效液相色谱串联质谱法同时测定牛奶中三种头孢菌素类抗生素的研究

王建凤，石佳丽，刘艳，杜振霞，贾丽，冯月超，范筱京，张经华

(1.北京化工大学，北京 100029；2.北京市理化分析测试中心，北京市食品安全分析测试工程技术研究中心，北京 100089；3.北京联合大学旅游学院，北京 100101)

超高效液相色谱串联质谱法同时测定牛奶中三种头孢菌素类抗生素的研究

王建凤1,2，石佳丽2,3，刘艳2，杜振霞1，贾丽2，冯月超2，范筱京2，张经华2

(1.北京化工大学，北京 100029；2.北京市理化分析测试中心，北京市食品安全分析测试工程技术研究中心，北京 100089；3.北京联合大学旅游学院，北京 100101)

本试验建立了固相萃取-超高效液相色谱串联质谱（SPE-UPLC-MS/MS）同时检测牛奶中3种头孢菌素类抗生素含量的方法，同时对三种物质断裂机理进行考察。样品用0．5mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液提取，MCX固相萃取柱进行净化，液相色谱串联质谱法进行测定，采用多反应监测（MRM）模式进行定性和定量分析。3种头孢菌素类抗生素的检出限（S/N=3）范围为0．1～0．5μg/kg，定量限（S/N=10）范围为0．25～1μg/kg，样品加标回收率范围为90%～117%。

MCX固相萃取；超高效液相色谱串联质谱；头孢菌素类抗生素；牛奶

头孢菌素类抗生素是分子中含有头孢烯的半合成抗生素，又称先锋霉素类抗生素，其作用方式是杀菌性的，对各种细菌产生的β-内酰胺酶稳定，对β-内酰胺酶的产生菌也具有优异的抗菌活性，其临床治疗效率高、抗菌谱广、杀菌力强，相比青霉素更具耐酸及耐青霉素酶、过敏反应少、毒性低等特性[1]，因此在兽医临床及禽畜饲养中得到广泛的应用。针对畜禽在饲养过程中易滥用头孢菌素类抗生素引起的残留，可能会导致消费者在食用后带来的健康损害、抗药及过敏的风险问题[2]，动物源性食品中抗生素残留问题必须引起高度重视。

目前，针对头孢菌素类抗生素的检测，钟长鸣等[3]运用液相色谱法测定片、胶囊、颗粒中的头孢羟氨苄，为药典中头孢羟氨苄的测定提供了参考；夏登宁等[4]运用液相色谱法测定血浆中的头孢氨苄，采用流动相为pH3.0的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液：乙腈：甲醇(76∶16∶8)，色谱行为良好；何文亮等[5]运用表面活性剂增敏荧光分光光度法测定牛奶中头孢拉定，利用头孢拉定在碱性条件下降解产物荧光强度被表面活性剂增敏特性，运用荧光分光光度法对牛奶中的头孢拉定进行测定；郭丹等[6]运用高效毛细管电泳法测定注射用头孢拉定的含量，该方法准确快速，可为头孢拉定的质量控制提供参考；何东旭等[7]运用高效毛细管电泳同时测定了头孢噻肟与头孢羟氨苄，方法精密度高。报道较多的是液相色谱法[1,3,4]、荧光分光光度法[5]、毛细管电泳法[6,7]等，但这些方法的灵敏度均较低。

为了进一步提高头孢菌素类抗生素检测技术的灵敏度和定性、定量准确度，以液相色谱-三重四极杆串联质谱（UPLC-MS/MS）为代表的高灵敏度质谱技术的开发成为抗生素检测技术的发展趋势[8～11]。Nasi Li等[9]建立了同时检测牛奶中2种头孢菌素类的UPLC-MS/MS的分析方法；张奥博[10]建立了牛奶中3种头孢菌素类物质同时检测的UPLC-MS/MS的分析方法。Xiao-Lin Hou等[11]建立了牛奶中头孢拉定和头孢噻吩的UPLC-MS/MS的分析方法，并运用固相萃取进行净化；王建凤等[12]运用HLB固相萃取柱，建立了牛奶中6种头孢菌素类的分析方法。

本试验针对3种碱性头孢菌素类抗生素，考察了其断裂机理，同时由于MCX对于净化和富集碱性化合物效果较好，运用MCX固相萃取柱，建立了牛奶中3种碱性头孢菌素类抗生素的UPLC-MS/MS检测方法，并将其应用于实际样品的检测中。

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

UPLC XEVO-TQ MS型超高效液相色谱串联质谱仪（Waters公司）；Acquity UPLC BEH C18色谱柱（1.7μm，2.1＊50mm，Waters公司）；CR22G高速冷冻离心机（Hitachi公司）；Vortex-Genie 2涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；N-EVAP112氮吹仪（美国Organomation公司）；OASIS MCX固相萃取柱（6cc，500mg，Waters公司）。

乙酸铵（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）；甲醇（色谱纯，Optima公司）；甲酸（色谱纯，Alfa Aesar公司）；氢氧化钠（分析纯，西陇化工股份有限公司）；盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸氢二钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氨水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸锌（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；超纯水。

0.05 mol/LPBS：称取11.4g磷酸氢二钾溶解于1L超纯水中，使用时用1mol/L NaOH和6mol/L HCl调节至合适的pH值；2%甲酸（V/V）：准确量取2mL甲酸，与98mL超纯水混合均匀；2%氨水-甲醇（V/V）：准确量取2mL氨水，与98mL甲醇混合均匀；0.5mmol/L乙酸铵水溶液（A）：称取0.193g乙酸铵溶解于0.5L超纯水中，过0.45μm滤膜，用甲酸调pH值至5。183g/L乙酸锌水溶液：称取219g乙酸锌于烧杯中，加少量水超声溶解，待溶解后转移至1L的容量瓶中，多次洗涤烧杯，合并洗涤液于容量瓶中，再加入32mL乙酸，用水定容至刻度。

头孢类标准品的1 000mg/L标准储备液，保存于4℃。用甲醇-水（5∶95，V/V）稀释，得1mg/L混合标准工作液。

1．2 色谱质谱条件

色谱条件：B E H C 1 8色谱柱（1.7μm，2.1＊50mm）；流动相：0.5mmol/L乙酸铵水溶液（A，pH=5）和甲醇（B）；流速：0.2mL/min；柱温：25℃；进样量：5μL。梯度洗脱程序：0～2min，5%～10%B；2～5min，10%～25%B；5～7min，25%～35%B；7～9min，35%～95%B；9～11.5min，95%～5%B。

质谱条件：采用MRM模式，ESI（+）分析。MRM参数见表1。

表1 3种头孢菌素类抗生素的多反应监测质谱参数

1．3 样品处理

1.3.1 样品提取

准确称取2g牛奶样品于塑料离心管中，加入6mLPBS，涡旋混匀20s，再加入6mL乙酸锌溶液，涡旋混匀20s后离心10min，取上清液，待净化。

1.3.2 样品净化

将固相萃取柱依次用12mL甲醇、6mLPBS活化。样品以3mL/min的流速过柱。依次用3mLPBS、6mL2%甲酸、6mL甲醇淋洗柱，抽干，并用6mL2%氨水-甲醇洗脱目标物，收集洗脱液，于40℃氮吹至近干，用甲醇-水（5∶95，V/V）溶液定容至1mL，过0.22μm滤膜后待测。

2 结果与讨论

2．1 色谱条件和质谱条件

2.1.1 质谱条件的优化及其断裂机理研究

为得到待测头孢菌素类抗生素的最佳质谱条件，用甲醇-水（5∶95，V/V）溶液分别配制3种头孢菌素类抗生素的1mg/L的标准溶液，直接进行质谱分析，一级质谱全扫描确定其准分子离子峰，3种待测物质均在ESI+模式下获得准分子离子峰。以准分子离子峰为母离子进行二级质谱扫描，选择相对丰度较高的两个碎片离子作为定量和定性离子，分别优化各个离子对的锥孔电压和碰撞能量，其最优条件见表1。

三种物质的主要断裂形式均为β-内酰胺键断裂，头孢氨苄和头孢拉定均有158的碎片离子，该碎片离子为β-内酰胺键直接断裂，而头孢羟氨苄的114碎片离子则为β-内酰胺键直接断裂后的碎片离子又失去羧基官能团而产生。

图1 3种物质的相同断裂机理示意图

2.1.2 色谱条件的优化

以C18为色谱柱，甲醇-乙酸铵水溶液和乙腈-乙酸铵水溶液两个体系分别作为流动相，考察3种头孢菌素类抗生素在不同流动相体系中的响应，结果如图2所示，以甲醇-乙酸铵水溶液为流动相的灵敏度高于乙腈-乙酸铵水溶液，因此试验时选用甲醇-乙酸铵水溶液体系作为流动相。在该体系中，pH对头孢拉定的影响不大；与该体系pH为5时作比较，当pH为3时，头孢羟氨苄有明显增加，然而头孢氨苄响应降低41.45%，当pH为4时，头孢羟氨苄响应下降32.97%，综合考虑，选择甲醇-乙酸铵水溶液体系为流动相，并用甲酸调节pH为5，其色谱图如图3。

图2 流动相选择优化图

图3 3种物质的色谱图

2．2 标准溶液的稳定性

头孢菌素类抗生素中含有的β-内酰胺环结构不稳定，在酸、碱条件下会发生降解，中性条件下可能发生水解或分子重排[9]。为保证试验数据的准确性，考察了放置温度以及放置2d的标准溶液与新配制标准溶液的响应强度比值。

2.2.1 放置温度对标准溶液稳定性的影响

将配制好的标准溶液分别于室温（25℃）和冷藏（4℃）条件下放置1d，比较不同条件下放置标准溶液的稳定性差异。结果如图4所示，25℃和4℃下各标准溶液的峰面积分别相差1.32%、3.28%、6.44%，相差不大，因此该标准溶液在室温下放置1d和冷藏放置1d对试验结果基本无影响。

图4 25℃和4℃条件下放置1d标准溶液的稳定性

2.2.2 放置时间对标准溶液稳定性的影响

将配制好的标准溶液于4℃冷藏放置2d后与现配制的相同浓度的标准溶液进行比较，测其稳定性，结果如图5所示：各标准溶液的峰面积相差分别为4.31%、8.32%、2.82%，相差不大，因此4℃冷藏放置2d的标准溶液稳定性与现配的标准溶液相差不大。一般情况下，标准溶液均采用现用现配，然而特殊情况下，基于稳定性的测试，可以考虑使用冷藏条件下放置2d的标准溶液。

图5 冷藏放置2d和现配制的标准溶液稳定性

2．3 滤膜的影响

735 Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes promotes fracture healing in rats

运用超高效液相色谱柱进行分析的样品，通常需要运用滤膜进行过滤，然而部分化合物容易被滤膜所吸附，因此将配制好的标准溶液分别过膜和不过膜，比较过膜是否对待测化合物吸附，试验结果如图6所示。通过比较标准溶液过膜和不过膜后的试验结果，峰面积相差分别为1.96%、8.59%、13.92%，均在误差范围内，因此认为滤膜对待测化合物吸附作用不明显。

图6 滤膜对标准溶液的影响

2．4 提取液的优化

由于头孢菌素类抗生素的结构中都同时含有酸性和碱性基团，化合物结构比较复杂，性质差别比较大，通常均易溶于水，受pH值的影响也比较大，在样品提取操作中，使用1mol/L的NaOH和6mol/L的HCl调节PBS的pH值，使用pH为6.5的PBS提取[12]。

由于提取液的体积对提取效率起着至关重要的作用，因此对提取液PBS的体积进行优化。分别选择6mL、8mL、10mL进行试验，观察试验结果。如图7所示，随着提取液体积的增加，回收率基本稳定不变，因此选择提取液的体积为6mL。

图7 提取液体积对回收率的影响

2．5 标准曲线、线性范围、检出限、定量限、回收率、精密度

2.5.1 检出限和定量限

2.5.2 标准曲线及线性范围

配制一系列不同浓度的混合标准溶液，按上述分析条件进行测定，以峰面积对浓度做标准曲线。结果表明，各物质在线性范围内线性关系良好，3种物质线性相关系数（R2）均大于0.995。

2.5.3 回收率和精密度

在空白的牛奶基质中添加高、中、低三个水平混合标准品进行回收率试验，按照2.3.1和2.3.2的方法进行样品制备，测定方法回收率和精密度列于表2，回收率的结果均介于90%～117%，精密度（RSD）小于14%。

2.5.4 实际样品检测

将本方法用于市售牛奶样品的检测，试验结果表明，均未检出上述3种头孢菌素类抗生素。

表2 3种头孢菌素类抗生素在牛奶基质中的检出限、定量限、添加回收率和相对标准偏差

3 结论

本研究采用UPLC-MS/MS测定牛奶中的3种头孢菌素类抗生素药物残留，并对其断裂机理进行研究。采用pH为6.5的PBS作为提取液，经MCX固相萃取柱净化，运用超高效液相色谱串联质谱仪进行检测，外标法定量。目前欧盟EC 2002/657/EC[13]规定头孢氨苄在牛奶中的最大残留限量为100μg/kg，因此该方法能够满足牛奶样品中头孢菌素类抗生素的分析要求。

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[13] European Commission Decision 2002/657/ EC[S]．

Simultaneous Determination of Cefadroxil, Cephalexin and Cefradine in Milk by Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

WANG Jian-feng1,2, SHI Jia-li3, LIU Yan2, DU Zhen-xia1, JIA Li2, FENG Yue-chao2, FAN Xiao-jing2,ZHANG Jing-hua2
(1.Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029; 2.Beijing Engineering Research Center of Food Safety Analysis, Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089; 3.College of Tourism, Beijing Union University, Beijing 100101)

To developed a method for the detection of 3 kinds of cephalosporins in milk by solid phase extraction coupled with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-UPLC-MS/MS). The same fracture mechanism of the three cephalosporins was investgated. The samples were extracted with 0.05 mol/L phosphate buffer solution, cleaned up by MCX solid phase extraction column, and then analyzed by UPLC-MS/MS with multiple reaction monitoring (MRM) mode. The LODs and LOQs of 3 kinds of cephalosporins were in the range of 0.1～0.5 µg/kg and 0.25～1µg/kg, respectively, with the mean recoveries varied from 90% to 117%.

MCX; UPLC-MS/MS; Cephalosporins; Milk

TS251.1

A

1004-4264（2017）05-0040-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.05.011

2016-10-24

北京市科技计划项目（Z141100002614020）。

王建凤，助理研究员，主要研究方向为食品检测技术。

杜振霞，教授，主要研究方向为食品及材料检测技术。