甲状腺癌中生物标志的筛选及基于生物学信息的验证

熊 斌

(川北医学院附属医院新区，四川 南充 637000)

甲状腺癌中生物标志的筛选及基于生物学信息的验证

熊 斌

(川北医学院附属医院新区，四川 南充 637000)

目的 探讨甲状腺癌中生物标志的筛选方法及基于生物学信息的验证效果。方法 甲状腺癌患者189例为观察组；取同期入院健康体检者189例为对照组。采用生物信息学预测靶基因的方法完成生物标志的筛选，采集两组外周血，采用受试者工作特征曲线(ROC)对差异性基因进行验证。结果 观察组差异表达miRNA基因中AXIN2、 ITGA3表达水平显著低于对照组，TP53INP1、TP53INP2显著高于对照组(均P<0.05)； 差异基因AXIN2、TP53INP1、TP53INP2 和 ITGA3诊断敏感性比较差异无统计学意义(P>0.05)；AXIN2、TP53INP1、TP53INP2诊断特异性高于ITGA3(P<0.05)。结论 甲状腺癌患者外周血中AXIN2、TP53INP1、TP53INP2 和 ITGA3表达存在明显的差异，且均经过生物学信息得到验证，AXIN2、TP53INP1和TP53INP2能提高甲状腺乳头状癌的诊断准确率。

甲状腺癌；生物标志；生物学信息

甲状腺乳头状癌(PTC)占全部甲状腺癌的80.0%，患者发病早期临床症状缺乏特异性，多数患者一旦确诊已经是中、晚期，从而错过了最佳治疗时机〔1〕。目前临床上对于甲状腺癌诊断方法相对较多，如血清甲状腺激素测定、超声诊断检查等〔2〕。但是临床诊断时10.0%患者难以最终确诊。完整的生物学信息主要包括3个部分：①根据存在的问题建立更具针对性的信息数据库；②利用计算机等多种方法开发、挖掘生物学数据，从而研制出数据的算法；③利用各种工具完成不同类型生物学数据的处理和分析。此外，生物信息学中包括了基因功能的预测假说，能为生物学的实验设计提供思路和方法〔3〕。由于肿瘤的发生、发展是一个多因素、多基因参与的过程，在其发生、发展过程中癌细胞能分泌、合成各种物质到体液中，临床将其称为肿瘤标志物(TM)，这些物质具有筛查功能、诊断功能、判断预后及监测疗效的功能。目前临床上常用的TM筛查方法包括〔4〕肿瘤细胞株、肿瘤组织及肿瘤患者血液、分泌物等，常用方法主要有全基因组芯片扫描、蛋白差异表达等，不同的筛查方法各有优缺点，且临床缺乏统一的标准。针对上述研究中存在的问题及不足，本实验采用生物信息学预测靶基因的方法完成生物标志的筛选，并基于生物学信息完成对生物标志的验证。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年7月至2016年8月南充市州北医学院附属医院收治的甲状腺癌患者189例为观察组，男98例，女91例，年龄40～85〔平均(64.9±2.9)〕岁。纳入标准：①符合甲状腺癌临床诊断标准；②经过影像、生化指标检查及手术病理最终确诊。取同期入院健康体检者189例为对照组，男93例，女96例，年龄41～84〔平均(63.1±2.8)〕岁。排除标准：①合并有影响效应指标观测、判断的其他生理或病理状况者；②合并严重心、肝、肾功能异常者；③合并传染性疾病及意识不清或存在精神障碍者。

1.2 主要仪器及试剂 实时定量PCR试剂盒(大连 Takara)，miRNA芯片及全基因组微珠芯片(美国 Illumina)，红细胞裂解液(北京 Aidlab)，立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)，无菌超净工作台(江苏净化设备厂)，移液器吸头(江苏海门)，凝胶成像分析系统(美国 BioRad)。

1.3 方法

1.3.1 生物标志的筛选

1.3.1.1 miRNA靶基因预测 miRNA和靶基因之间的相互作用具有一定的规律性，可以采用编程的方法进行预测，采用软件根据种子区原则将miRNA 5′端第2～8位碱基与miRNA 3′UTR的一段序列完成配对。见图1。

由于不同的网站容纳的miRNA及靶基因数据库不同，为了进一步提高靶基因的筛选准确率，选择4个及以上网站完成生物标志的筛选〔5〕。

1.3.1.2 TCGA数据 TCGA是美国国家肿瘤中心发起的，共收录了20种肿瘤类型，而对于甲状腺患者共收集并公开507例，包括493个外显子、507例单核苷酸多态性、505例表达谱mRNA及505例临床资料。在图2界面下选择RNASeqV2、miRNASeq 和 Clinical等按钮，输入邮箱地址，申请TCGA数据连接，并完成数据的下载。见图2〔6〕。

1.3.1.3 生物标志的筛选 对入选的189例甲状腺癌患者组织的数据库进行整理，为了进一步提高检出效率，剔除检测过程中出现某检出信号值为0时的数据和平均信号强度<100的数据。最终将癌平均信号/正常信号值>1.99或<0.509的数据进行后续处理分析。对499例差异表达的miRNA进行肿瘤信号值/正常信号值的计算，对于高表达或低表达占整体85.0%的miRNA纳入后续分析。利用5个预测靶基因软件完成基因的预测〔7〕。将预测出的靶基因与表达谱芯片数据库进行对比，参考miRNA负向调控靶基因原理，将上调的预测靶基因与下调的差异miRNA，下调的预测靶基因与上调的miRNA进行汇总，并作为差异miRNA在甲状腺癌中调控的预测靶基因，完成肿瘤信号值/正常信号值的计算，对于计算数据高表达或低表达占整体85%的基因进行筛选，提取基因芯片未出现或不符合要求的靶基因，最终获得差异生物标志〔8〕。

1.3.2 ROC曲线对差异性基因进行验证 (1)数据库的建立。将TCGA甲状腺mRNA数据中505个样本芯片数据汇总到数据库中，建立数据库，见图3。将TCGA甲状腺癌mRNA数据中506个样本的mRNA芯片数据汇总到数据库中，建立数据库，

见图4。将TCGA甲状腺癌mRNA数据中505个样本中汇总到一个数据库中，建立数据库。见图5。

图1 miRNA靶基因预测

图2 甲状腺TCGA数据获取申请

图3 建立芯片数据数据库

图4 建立TCGA甲状腺癌mRNA数据库

图5 建立TCGA甲状腺癌临床资料数据库

将试验中选择的甲状腺癌患者189例和健康对照组189例基本信息录入其中，入院后第2天空腹抽取4 ml静脉血，采用血清分离管离心后在冰上进行30 min凝结，2 000 r/min，离心10 min，取上层清夜，以200 μl分装入1.5 ml EP管中，通过测定生物指标的敏感度和特异性绘制ROC曲线，通过计算曲线下面积，判断其灵敏度和特异度〔9〕。

1.4 诊断标准误评价指标 通过受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)进行甲状腺癌诊断。对于AUC总分1分者，得分越高，判断准确性越高〔10〕。

1.5 统计学方法 应用SPSS18.0软件进行χ2检验、t检验。

2 结 果

2.1 两组AXIN2、TP53INP1、TP53INP2 和 ITGA3等差异基因的表达 观察组差异表达miRNA基因中AXIN2、 ITGA3表达水平显著低于对照组(P<0.05)；TP53INP1、TP53INP2显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2 AXIN2、TP53INP1、TP53INP2 和 ITGA3诊断敏感性、特异性比较 AXIN2，TP53INP1，TP53INP2 和 ITGA3诊断敏感性比较差异无统计学意义(P>0.05)；AXIN2，TP53INP1，TP53INP2诊断特异性高于ITGA3(P<0.05)。见表2和图6。

表1 两组基因AXIN2，TP53INP1，TP53INP2和 ITGA3的差异表达

表2 AXIN2，TP53INP1，TP53INP2 和 ITGA3诊断敏感性、 特异性比较

图6 AXIN2，TP53INP1，TP53INP2 和 ITGA3的ROC比较

3 讨 论

甲状腺癌已经位于女性恶性肿瘤的第5位，常见的甲状腺癌主要包括乳头状癌(占90.0%)、滤泡癌及甲状腺髓样癌(3%～12%)等，发病早期临床症状缺乏特异性，多数患者一旦确诊已经是中、晚期，错过了最佳治疗时机。临床上对于甲状腺癌的诊断以触诊、彩色超声、同位素显像及穿刺活检检查为主，其中穿刺活检最准确，但具有创伤性，难以满足临床诊断需要〔11〕。基因芯片技术是将一段由寡聚核苷酸或cDNA构成的脱氧核苷酸序列进行固定，待测样品的RNA反转录合成新的cDNA后，染色并与之进行基因序列的分子杂交，使得待测样本的cDNA与片段基因上的DNA进行有效的结合。通过比较待测序列与非患病序列之间的差异，能为疾病的诊断、治疗等提供依据和参考。而在基因芯片技术中生物信息学发挥了重要的作用，利用生物信息学能利用虚拟计算机技术等作为工具，分析出相对重要的规律性信息。研究甲状腺差异基因时首先考虑样本量的大小，由于患者之间存在明显的个体差异，单个基因芯片的检测并不能准确反映该类疾病的一般规律〔9〕。本实验为了获得多重生物信息，通过以下方法完成生物标志的筛选：(1)数据整理；(2)与试验中建立的数据进行比较；(3)采用靶基因预测网站完成基因的预测。本研究表明甲状腺癌的发生、发展是一个多因素、多基因过程，且在肿瘤的诊断中AXIN2能发挥重要的作用。AXIN2属于wnt通路中相对比较重要的稳定因子，能使β-连环蛋白降解，其低表达是恶性肿瘤发生中相对比较重要的因素。同时，AXIN2主要定位在常染色体中，在结直肠癌中发挥了重要的作用，而在乳腺癌和神经母细胞瘤等恶性肿瘤中能发挥抑癌作用。在甲状腺癌患者中，由于AXIN2蛋白水平相对较低，使得其与肿瘤的发生、发展关系密切，并且AXIN2水平的高低还与病灶的数量、甲状腺浸润程度、淋巴结转移和肿瘤瘤体大小等关系密切。TP53INP1、TP53INP2在是否存在残余肿瘤患者中表达存在差异。TP53INP1，TP53INP2水平相对较高的患者，易发生远处转移，临床应该立即采取有效的措施进行干预治疗。临床上甲状腺癌患者诊断时应该加强AXIN2，TP53INP1、TP53INP2基因的监测，发挥不同指标优势，为临床治疗提供依据和参考〔12〕。

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〔2016-11-19修回〕

(编辑 袁左鸣)

四川省卫生计划项目(No.2015-0122)

熊 斌(1979-)，女，硕士，主治医师，主要从事甲状腺乳腺外科研究。

R73

A

1005-9202(2017)11-2617-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.007