五大连池火山岩土壤发育过程中根际细菌多样性分析

张建峰，何佩佩，周奇，马丽娜，田磊，田春杰*

（1.吉林农业大学生命科学学院，长春130118；2.中国科学院东北地理与农业生态研究所，长春130102）

五大连池火山岩土壤发育过程中根际细菌多样性分析

张建峰1,2，何佩佩1，周奇1，马丽娜2，田磊2，田春杰2*

（1.吉林农业大学生命科学学院，长春130118；2.中国科学院东北地理与农业生态研究所，长春130102）

选取五大连池火山群中三座火山为研究对象，采用PCR-DGGEB联用技术研究火山岩土壤发育过程与根际细菌多样性间相关性。结果表明，随火山喷发后时间推移，三座火山南坡有机质和全氮含量先增后稳，北坡土壤有机质和全氮含量先增后减，南北坡土壤pH不断升高。运用Bio-Dap软件分析发现，随时间推移，三座火山南坡细菌丰富度和多样性指数变化趋势为先增后减，北坡为先减后增，南北坡均匀度变化趋势均先增后稳。采用SPSS软件作相关性分析，三座火山南北坡根际细菌多样性指数及丰富度与土壤有机质显著正相关（P＜0.05）。根际细菌群落多样性受火山岩土壤发育程度影响。

五大连池；火山岩；土壤发育；根际细菌；变性梯度凝胶电泳

五大连池火山群为活火山群，地质和生物演变相对频繁，是研究生物演变的样点之一。其中老黑山、东焦得布山和南格拉球山纬度相近，环境因子相似[1-2]。土壤成分准确反映土壤发育程度[3-5]。根际微生物指在植物根系周围，受根系生长影响土体中微生物，根际微生物-土壤-植物联系紧密[6-8]。刘丽等研究发现不同发育阶段杉木人工林通过改变土壤理化性质可影响土壤微生物群落结构[9]。杨尚东等研究结果表明炼山后不同时间段土壤细菌多样性不同[10]。前期研究发现根际真菌多样性受火山岩土壤发育程度影响[11]，对火山岩土壤发育过程中微生物变化规律和机理阐述不足，研究火山岩土壤发育过程中细菌、放线菌、土壤动物以及固氮菌、解钾菌等变化规律尤为必要。因此，本文选取五大连池火山群中三座火山为研究对象，应用土壤理化性质常规测定方法和PCR-DGGE联用技术，探讨火山岩土壤发育程度与根际细菌多样性之间相关性，为揭示火山岩土壤发育过程中根际细菌演化提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

五大连池世界地质公园，位于黑河市南部五大连池国家自然保护区及风景区内，地理坐标为E 125°57′42′′～126°30′48′′，N 48°30′46′′～48°50′43′′。研究区域分布14座火山，海拔353.7～602.6 m。属于寒温带大陆性季风气候，年平均气温-0.5℃，年平均降水量467.3 mm，无霜期平均120 d。该区地带性植被为温带针阔混交林，因受大兴安岭寒温带湿润气候和松嫩平原温带半湿润、半干燥气候综合影响，植被中混有寒温带针叶林和温带森林草原成分。

1.2 样品采集及处理

2014年8月12～16日，以五大连池三座火山老黑山（形成时间为265年）、东焦得布山（形成时间为0.70～0.88 Ma）和南格拉球山（形成时间为2.07～2.1 Ma）为样地。采集每座山山腰处土壤样品，按照文献[11-12]方法对土样预处理，风干样品测量理化性质，-20℃保存，一周内DNA样品提取。

1.3 研究方法

1.3.1 土壤理化测定

土壤有机质测定采用加热法；土壤全氮测定采用开氏消煮法；土壤速效氮测定采用碱解扩散法；土壤pH测定采用电位法；土壤速效磷测定采用浸提法；土壤速效钾测定采用火焰光度法[13]。

1.3.2 根际细菌DNA提取和纯化

提取根际细菌DNA使用离心柱形土壤基因组DNA提取试剂盒（购自TIANGEN公司），按说明书操作[14]。

1.3.2.116 S rDNA V3片段PCR扩增

16S rDNA基因V3区扩增：PCR模板为纯化后基因组DNA，两轮PCR扩增，兼并性引物27F-1492R扩增，采用对大多数细菌16S rDNA基因V3区具有特异性引物GC338-518PCR扩增，第一轮PCR引物为27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）扩增产物片段长约1 500 bp，PCR扩增体系（20 μL）同文献[11]；PCR扩增程序：94℃预变性3 min 30 s，35个循环94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min 30 s，最后72℃保持11 min。第二轮PCR引物为GC338（5'-CGCCCGGGGCGCGCCC CGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAA GTCTGGTGCC-3'）和518（5'-ATTACCGCGGCTGCT GG-3'）扩增产物片段长约200 bp，PCR扩增体系（20μL）：Premix10μL，引物F和R各2μL，DNA模板0.1 μL，ddH2O 5.9 μL；PCR扩增程序为：94℃预变性5 min，35个循环94℃变性30 s，52℃退火50 s，72℃延伸40 s，最后72℃，保持10 min[15]。

1.3.2.2 PCR反应产物变性梯度凝胶电泳

以引物GC-338F/518R扩增出目片段为样品，DGGE电泳。电泳缓冲液1×TAE，变性梯度40%～60%，电压90 V，时间12 h；经EB替代性核酸染料对凝胶染色浸泡1 h[11]。

1.3.2.3 数据处理

DGGE凝胶图像分析采用Quantity One软件；根际细菌物种多样性分析采用Bio-Dap软件；数据相关性比较采用SPSS软件。

2 结果与分析

2.1 老黑山、东焦得布山和南格拉球山南坡和北坡土壤理化性质

结果见表1。

表1 五大连池火山群南北坡土壤理化性质Table 1Soil physical and chemical properties of the north and south slopes of Wudalianchi volcanic group

由表1可见，火山南坡土壤有机质、全氮、速效氮和速效钾含量随火山喷发后时间推移先增后缓，速效磷和pH不断升高。火山北坡有机质、全氮和速效磷含量随火山喷发后时间推移先增后减，速效氮和速效钾含量先增后缓，pH不断升高。

老黑山、东焦得布山和南格拉球山三座火山南坡土壤有机质和速效氮含量低于北坡，可能原因是南坡为阳面，光照较充足，温度较高，南北坡优势树种种类不同。树种种类是影响土壤理化性质重要因素[16]。三座火山南坡土壤pH较高，因其温度较高，生物活性较大，火山喷发出酸性硫化物质被分解利用，土壤pH升高。三座火山南坡速效磷和速效钾含量较高。老黑山和东焦得布山南坡土壤全氮含量较低，南格拉球山南坡土壤全氮含量较高。

2.2 老黑山、东焦得布山和南格拉球山南北坡根际细菌DGGE图谱分析

结果见图1。

通过DGGE试验得到老黑山、东焦得布山和南格拉球山南北坡优势树种根际细菌16SrDNA V3区图谱（见图1），条带数量代表根际细菌群落多样性，条带亮度反映根际细菌群落丰度[17]。条带a、b、d、f、j、k、m和n为样品广谱性条带，其中a、b、d、f、m和n条带亮度较暗，说明六个根际细菌种群数量较少；j条带亮度较高，说明根际细菌j种群数量较多。c条带为样品6、12、13、14、15、16和17特异性条带，样品12、14、16和17根际细菌c种群数量较多；i条带为样品1、3、4、5和6特异性条带，样品1、3和4根际细菌i种群数量较多。e条带为样品23特异性条带且丰度较高，l条带为样品23特异性条带且丰度较高。结果表明，三座火山南北坡根际细菌具有丰富种群多样性，相同根际细菌种群在不同样品中丰度不同。

2.3 老黑山、东焦得布山和南格拉球山南北坡根际细菌群落相似性

结果见图2。

老黑山、东焦得布山和南格拉球山三座火山根际细菌群落结构相似性变化趋势为随火山喷发后时间推移先降后升。三座火山中老黑山根际细菌群落结构相似度最高，相似值为0.44；东焦得布山根际细菌群落结构相似度最低，相似值为0.28。说明，在火山岩土壤发育早期和晚期根际细菌群落结构处于稳定状态，而在火山岩土壤发育中期根际细菌群落结构处于活跃状态，根际细菌群落结构变动幅度较大。一般认为相似值＞0.6两个群体相似性较好[15,17]。三座火山根际细菌群落结构相似值均＜0.6，说明根际细菌多样性受火山岩土壤发育程度影响。老黑山和东焦得布山南北坡根际细菌群落结构相似性变化趋势一致，均为南坡根际细菌群落结构优于北坡。但南格拉球山南北坡根际细菌群落结构相似性较差。表明坡向是根际细菌群落结构影响因素之一。

图1 五大连池三座火山南北坡根际细菌16SrDNADGGE图谱分析Fig.1DGGE map analysis of 16S rDNA of rhizosphere bacteria in the north and south slopes of three volcanoes in Wudalianchi

图2 根际细菌DGGE图谱UPGAMA聚类分析Fig.2UPGAMA cluster analysis of rhizosphere bacterial DGGE map

2.4 老黑山、东焦得布山和南格拉球山南北坡根际细菌16S rDNA多样性

由表2可知，三座火山南北坡根际细菌丰富度和多样性指数变化趋势一致。三座火山南坡，东焦得布山丰富度和多样性指数最高，分别为15和2.60；南格拉球山丰富度和多样性指数最低，分别为12和2.44。三座火山北坡，南格拉球山丰富度和多样性指数最高，分别为16和2.69；东焦得布山丰富度和多样性指数最低，分别为13和2.45。表明坡向是影响根际细菌多样性主要因素。三座火山南北坡均匀度变化趋势一致，随火山喷发后时间推移均匀度先增后稳。

表2 五大连池火山南北坡根际细菌多样性Table 2Rhizosphere bacterial diversity in the north and south slopes of Wudalianchi volcanoes

2.5 土壤理化性质和根际细菌多样性相关性

三座火山南坡根际细菌多样性指数和丰富度分别与土壤有机质显著正相关（P＜0.05）（见表3），多样性指数和丰富度与土壤pH呈负相关，多样性指数和丰富度与土壤全氮、土壤速效磷、土壤速效氮和土壤速效钾正相关，但相关性不显著。三座火山北坡根际细菌多样性指数和丰富度与土壤有机质显著正相关（P＜0.05），多样性指数和丰富度与土壤全氮、土壤速效磷、土壤速效氮、土壤速效钾和土壤pH均呈正相关。大多数细菌适宜生长在偏中性环境中，酸化较严重土壤影响细菌生长和繁殖[18]。

本试验相关分析表明，在pH 5.71～6.53范围内，细菌多样性受土壤理化影响较大。

表3 土壤理化指标与根际细菌多样性之间相关性Table 3Correlations between soil physical and chemical indicators and rhizosphere bacterial diversity

3 讨论和结论

本研究选取五大连池火山群中土壤发育程度不同的三座火山，即老黑山、东焦得布山和南格拉球山，研究发现，老黑山、东焦得布山和南格拉球山南坡土壤有机质、全氮和速效氮含量变化趋势相同，随火山喷发后时间推移先升后稳，原因是土壤中氮来源于有机质矿化作用，土壤全氮和速效氮在土壤中保持动态平衡状态，土壤全氮和速效氮含量受土壤有机质含量影响。土壤有机质变化情况与福英等研究结果[19]不同，原因是前人研究苔藓对有机质影响，而本试验研究优势树种对有机质累积影响。土壤pH和土壤速效磷含量不断升高，可能是火山喷发时喷射出大量硫化物，土壤pH偏酸性，而大多细菌和植物存在于偏中性土壤中，随时间推移，微生物和植物分泌大量碱性物质使土壤向利于细菌和植物生长繁殖方向发育，土壤pH不断升高。三座火山南北坡土壤理化变化趋势不一致，原因是南坡温度、微生物和植物活性较高，致南北坡土壤理化变化趋势不一致。这与Sharma研究结果[20]相同，说明坡向可影响土壤理化特性。

本试验采用PCR-DGGE技术测定分析老黑山、东焦得布山和南格拉球山南北坡根际细菌多样性。结果表明，三座火山南坡根际细菌丰富度与多样性指数变化趋势一致，丰富度和多样性指数先升后降；三座火山北坡丰富度和多样性指数先降后升；三座火山南北坡均匀度变化趋势一致，均为先升后稳。但岳琳艳研究发现，随着演替正向，根际细菌PLFAs含量变化显著[21]。原因是五大连池火山群是活火山群，火山喷发对根际细菌演替产生干扰。SPSS软件分析土壤理化和根际细菌多样性相关性，三座火山南北坡丰富度和多样性指数与有机质呈显著正相关（P＜0.05）。三座火山南北坡丰富度和多样性指数与土壤全氮、速效氮、速效磷和速效钾呈正相关。三座火山南坡丰富度和多样性指数与土壤pH呈负相关，但相关不显著，三座火山北坡丰富度和多样性指数与土壤pH呈正相关。原因是大多数细菌适宜生长于偏中性环境中，由于三座火山南北坡土壤环境中根际细菌对酸性环境具有耐受性，因此土壤pH并非影响根际细菌多样性关键因素。

综上所述，本试验采用土壤理化性质常规测定方法和根际细菌16S rDNA序列PCR-DGGE技术，研究火山岩土壤发育与根际细菌多样性之间内在联系。结果表明，火山岩土壤发育不同时期土壤理化性质发生变化，根际细菌多样性存在差异，根际细菌与土壤理化性质相关，受土壤理化性质影响。火山岩土壤发育程度是影响根际细菌多样性重要因素。

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Diversity analysis of the rhizosphere bacteria in soil development of Wudalianchi volcanic rock

/ZHANG Jianfeng1,2,HE Peipei1,ZHOU Qi1,MA Lina2,TIAN Lei2,TIAN Chunjie2(1.School of Life Science,JilinAgricultural University,Changchun 130118,China;2.Northeast Institute of Geography and Agroecology,Chinese Academy of Sciences,Changchun 130102, China)

Using the active volcanoes of Wudalianchi as the research object and selecting the three volcanoes with larger eruption interval as the representatives,the correlation of soil development and the diversity of rhizosphere bacteria was studied with PCR-DGGE combination technology.The results showed that,with the extension of time after volcanic eruption,the changing trend of the soil organic matter and total nitrogen content in south slope of the three-volcano was leveling off after increasing,while the trend in the north was decreasing after increasing.Finally,the soil pH of north and south slopes of the three-volcano was consistently rising with the changing trend.BIODAP software was used to analyze the diversity of rhizosphere bacteria,and the results indicated that,with the extension of time after volcanic eruption,the changing trend of bacterial richness and diversity index in south slope of the three-volcano was decreasing after increasing,while the trend in the north slope was increasing after decreasing.And the evenness variation trend of the three-volcano south and northslopes was the same,which seemed to be leveling off after increasing.The rhizosphere bacterial abundance and diversity index had significantly positive correlation with the soil organic matter by using SPSS software for the correlation analysis(P＜0.05).In conclusion,the community diversity of rhizosphere bacteria was influenced by the degree of soil development.

Wudalianchi;volcanic rocks;pedogenesis;rhizosphere bacterial;denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)

S154.3；Q938.1

A

1005-9369（2017）05-0065-07

时间2017-5-23 12:29:56[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170523.1229.014.html

张建峰,何佩佩,周奇,等.五大连池火山岩土壤发育过程中根际细菌多样性分析[J].东北农业大学学报,2017,48(5):65-71.

Zhang Jianfeng,He Peipei,Zhou Qi,et al.Diversity analysis of the rhizosphere bacteria in soil development of Wudalianchi volcanic rock[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(5):65-71.(in Chinese with English abstract)

2017-03-21

吉林省教育厅项目（2016176）；国家重点研发计划项目（2016YFC0501202）；吉林省科技厅项目（20160412017XH）

张建峰（1973-），男，副教授，博士，研究方向为土壤微生物。E-mail:88657158@qq.com

*通讯作者：田春杰，研究员，研究方向为微生态与植物营养。E-mail:tiancj@iga.ac.cn