基于抗血栓作用的油茶枯饼药物制备物质量表征分析＊

王亚利，张小茜，李林福，武秋红，路东波，李文霞，石任兵,3＊＊

（1.北京中医药大学中药学院国家中医药管理局中药经典名方有效物质发现重点实验室北京100102；2.北京市药品检验所北京102206；3.北京市教委中药质量控制技术工程中心北京100102）

基于抗血栓作用的油茶枯饼药物制备物质量表征分析＊

王亚利1，张小茜2，李林福1，武秋红1，路东波1，李文霞1，石任兵1,3＊＊

（1.北京中医药大学中药学院国家中医药管理局中药经典名方有效物质发现重点实验室北京100102；2.北京市药品检验所北京102206；3.北京市教委中药质量控制技术工程中心北京100102）

目的：优选油茶枯饼抗血栓药效的最佳药物制备物形式，为筛选油茶枯饼相关抗血栓药物奠定研究基础。方法：采用本课题组前期建立的HPLC-PDA分析法测定油茶枯饼制备物中主要指标性成分的含量、含量相对比值、相对量以及出膏率，结合其抗血栓药效作用，对油茶枯饼各药物制备物的质量进行分析。结果：3种油茶枯饼制备物的抗血栓作用强弱顺序为：富集物＞醇提物＞水提物。与醇提物与水提物相比，油茶枯饼富集物的有效指标性成分含量更高，出膏率更低，给药量更小，抗血栓作用更强。结论：通过分析有效成分的含量、比例等指标，对药物体系组成的进行质量分析可知，药效的显著提高得益于制备物中各药效指标成分含量的提高及配比的优化。

油茶枯饼药物体系质量考量药学-药效

油茶Camellia oleifera Abel为多年生木本油料作物，是中国特有的树种。油茶籽经压榨制成的油茶油具有清热解毒、活血散瘀、止痛等功效[1]。油茶枯饼为油茶籽榨油后的剩余物。近年来的文献报道显示，油茶枯饼具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、杀虫等多种药理活性[2-5]。本课题组前期研究采用腹腔注射家角叉菜胶复制大鼠血栓模型[6]，通过研究发现山柰酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷、山柰酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷、Canelliasaponin B1、腺苷、腺嘌呤为其发挥抗血栓作用的主要药效成分。通过运用本课题组建立的基于药物体系质量评价模式[7-11]，测定油茶枯饼药物制备物5种药效成分的含量，确定其在不同制备物中的含量变化。以药效相关度作为主要评价标准，提高药效成分的含量，通过制备使组成比例更加合理，并进行药物制备物“药学-药效”质量表征，以确定其具有最佳药效的药物制备物。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Waters 2695高效液相色谱仪、Empower Pro软件系统（上海沃特世科技有限公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；HH-S6型数显恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）；Sartorius BT25S型十万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.1.2 试剂与药品

山柰酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷对照品（实验室自制，批号：20160110，纯度≥98%，下文简称为“黄酮a”）、山柰酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷对照品（实验室自制，批号20160110，纯度≥98%，下文简称“黄酮b”）；腺嘌呤对照品（北京鼎国公司，批号：150509）、腺苷对照品（北京鼎国公司，批号：KM0529CA14）；CamelliasaponinB1对照品（实验室自制，批号：20160316，纯度≥98%）。甲醇（色谱级，Fisher Scientific公司），95%酒精（汇海科仪科技有限公司），纯净水，其余试剂均为分析纯。

角叉菜胶（美国Sigma公司，批号：C1013-25 g）；金纳多（德国威玛舒培博士药厂，批号：6701014）；生理盐水（山东华鲁制药有限公司，批号：C13040602）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20120720）。

油茶枯饼的产地为湖南润农生态茶油有限公司（批号：20140118），保存于北京中医药大学中药化学系。油茶枯饼3种制备物分别为按照油茶枯饼制备工艺对油茶枯饼药材进行水提取得到油茶枯饼水提取物、醇提取得到油茶枯饼醇提取物和大孔吸附树脂纯化得到油茶枯饼富集物（由醇提取物富集即得）。

1.1.3 实验动物及分组情况

180-210 g SPF级SD大鼠48只，雌雄各半（北京维通利华实验动物技术有限公司），许可证号：SCXK（京）2012-0001。将实验动物随机分为空白组、模型组、阳性药组、水提物组、醇提物组、富集物组，每笼4只，每组雌雄各1笼。饲养温度：25℃，湿度40%-55%。

1.2 实验方法

1.2.1 油茶枯饼药物制备物有效指标性成分含量测定方法考察

在课题组前期建立的含量测定方法基础上（另发表）考察其方法学并进行含量测定[12]。

（1）酸性色谱条件

Waters XbridgeTMshield C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长为265 nm（黄酮a，黄酮b），203 nm（皂苷）。流速：1.0 mL·min-1，柱温：30℃，进样量：20 μL。流动相乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），洗脱梯度：10%-15.5%A（0-8 min），15.5%-15.5%A（8-16 min），15.5%-37.4%A（16-35 min），37.4%-37.4%A（35-61 min），37.4%-45%A（61-70 min），45%-45%A（70-85 min），45%-60%A（85-90 min）。

（2）中性色谱条件

Waters Xbridge shield RP18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长为260 nm（腺嘌呤、腺苷）；柱温：30℃；进样量：50 μL。流动相甲醇（A）-水（B），洗脱梯度，5%-5%A（0-12 min）；，5%-31%A（12-25 min）；，31%-31%A（25-30 min)；流速：0.9 mL·min-1。

（3）配制混合对照品溶液

精密称取各对照品适量，制得含黄酮a、黄酮b、Camelliasaponin B1质量浓度分别为0.069 6、0.062 2、0.086 8 mg·mL-1的混合对照品溶液Ⅰ，同法制成含腺苷、腺嘌呤质量浓度分别0.006 064、0.002 142 mg·mL-1的混合对照品溶液Ⅱ，两种对照品溶液均用0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。

（4）配制供试品溶液

精密称取油茶枯饼醇提取物适量，置10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇溶解并定容（用于酸性系统下的含量测定），20%甲醇溶解并定容（用于中性系统下的含量测定），摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，备用。由图1可知，供试品各峰在其测定波长下分离度良好。

1.2.2 抗血栓药效学实验方法

采用致血栓动物模型，给药组大鼠以每组规定的药液灌胃，空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水，连续给药6天。第7天灌胃1 h后除空白组不作处理外，其余各组动物均予以大鼠皮下注射角叉菜胶溶液造模。灌胃1 h后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，测定大鼠黑尾长度，之后腹主动脉取血，置于柠檬酸钠抗凝管，4℃，3 500 r·min-1，离心15 min，分离血浆，用放免法测定血浆中血栓素（Thromboxane，TXB2）和六酮前列腺素（6-keto-prostaglandin F1alpha，6-keto-PGF1a）的含量。

1.3 数据统计方法

2 结果与分析

2.1 基于抗血栓药效学作用结果

通过检测血浆中TXB2和6-keto-PGF1a指标的含量，探究在相同生药量下油茶枯饼各制备物对血栓疗效的强弱。由表1可知，模型组大鼠黑尾现象明显，各生化指标性与正常组比较有显著性差异（P＜0.01）。富集物组黑尾长度、TXB2和6-keto-PGF1a与模型组有显著性差异（P＜0.01），说明其具有显著的抗血栓药理作用；醇提物和水提物也有相应疗效，富集物药效最强，其次为稀醇提取物，水提物的药效最弱。通过比较富集物组与阳性药组结果可知，TXB2和6-keto-PGF1a的含量均低于阳性药组，表明其对TXB2和6-keto-PGF1a有良好的作用效果（表1）。

图1 油茶枯饼稀醇提取物的HPLC色谱图

表1 油茶枯饼制备物抗血栓药效结果（xˉ±s,n=8）

表2 不同药物制备物形式中5种有效指标性成分的平均含量/%（n=3）

2.2 质量评价体系

2.2.1 有效指标性成分含量分析

精密称取适量油茶枯饼药材及3种制备物，采用指标成分含量测定方法，对各制备物中指标成分的含量进行测定。结果显示，指标成分在油茶枯饼富集物中的含量显著提高（表2）。

2.2.2 各种类制备物出膏率质量分析

换算为相同生药量进行分析，计算得到各制备物出膏率及其相对比值，其中水提物出膏率最大，富集物的出膏率最小（表3）。

表3 制备物的出膏率及其相对比值

2.2.3 各指标性成分相对含量质量分析

以药材中5种具有抗血栓药效的指标性成分的量为1，在相同生药量下，基于指标性成分的含量和各制备物出膏率，分析各有效指标性成分的相对制备含量（即含量×出膏率），其结果显示油茶枯饼3中制备物中其指标性成分都有所减少（表4）。

2.2.4 含量相对比值质量分析

以腺嘌呤含量为参比，将腺嘌呤含量设为1。与腺嘌呤比较，其他4种主要指标性成分所占有比例高低顺序为：富集物＞醇提物＞水提物＞药材。该顺序与其抗血栓的药效强弱一致（表5）。

2.3 基于“药学—药效”对油茶枯饼药物制备物的质量分析

2.3.1 基于油茶枯饼有效指标性成分含量分析

各指标性成分在不同制备物中的含量有相应不同程度变化。以药材为基准，其他三种药物制备物中所含指标性成分与药材相比结果如下：富集物中5种指标性成分的含量变化幅度为：Camelliasaponin B1（5.36）＞黄酮b（5.16倍）＞黄酮a（4.97倍）＞腺苷（3.84倍）＞腺嘌呤（3.31倍）。与水提取物比较，富集物中5种指标性成分的含量变化幅度为：Camelliasaponin B1（3.18）＞黄酮b（2.63倍）＞黄酮a（2.44倍）＞腺苷（2.15倍）＞腺嘌呤（1.61倍）。与稀醇提取物相比，富集物中5种指标性成分的含量变化幅度为：Camelliasaponin B1（2.08）＞黄酮b（2.02倍）＞黄酮a（1.96倍）≈腺嘌呤（1.96倍）＞腺苷（1.92倍）。通过上述比例结果分析可知，设计优化油茶枯饼药物提取富集工艺时，重点关注并有目的地提高增幅大的各指标性成分含量。进一步针对药物药学和药效两方面进行质量分析。结果表明，通过不同的制备过程，个制备物中指标性成分比例增大时，其抗血栓作用也有明显的提升（图2）。

2.3.2 基于油茶枯饼有效指标性成分含量相对比值分析

以腺嘌呤含量为参比（即其含量设为1），分析不同药物制备物形式中5种有效指标性成分含量与腺嘌呤含量的比值（图3）。结合药效分析，油茶枯饼药物通过制备优化其有效成分比例后，药效也会相应提高。由此可知，在药物制备过程中，提高药效应不但需要提高有效成分含量，同时也应该合理的优化各药效指标成分间的配比。

表4 基于有效指标性成分相对制备量的油茶枯饼药物制备物质量考量

表5 基于有效指标性成分含量相对比值的油茶枯饼药物制备物质量表征

图2 油茶枯饼药物制备物中5种有效指标性成分含量变化

图3 油茶枯饼药物制备物中有效指标性成分含量相对比值的变化

2.3.3 基于药物制备物的出膏率分析

由表3可知，在相同生药量的条件下，油茶枯饼药物制备物的出膏率很小。实验结果显示，稀醇提取物、水提物、药材分别是其富集物出膏率的2.7倍、2.3倍、13倍。基于其抗血栓药效，对药物制备物进行质量分析的结果显示，服用量最小的油茶枯饼富集物的药效却强于其他2种制备物。由此可知，在药物制备过程中，药物有效指标成分通过有效富集可以在一定程度上提高药效。

2.3.4 基于油茶枯饼有效指标性成分的相对制备量分析

基于相同生药量，虽然药物在制备过程中各指标性成分转移量有所不同（图4），但不会对其药效有明显影响。

综上所述，为了保证油茶枯饼药物制备物的抗血栓药效，在制备过程中不仅需要优化各成分的含量，而且需要使其相对比值更加合理。在相同生药量给药的情况下，相对于油茶枯饼药材、水提取物、稀醇提取物，油茶枯饼富集物所需服用量更小。在确保药物体系完整性的前提下，制备过程提高了油茶枯饼抗血栓药效成分的含量，各指标性成分的相对比值也得到进一步优化，因而其抗血栓药效得到显著提高。因此，油茶枯饼抗血栓药物的最佳制备物是油茶枯饼富集物。

图4 油茶枯饼药物制备物各成分相对含量的变化

3 结语

以药物体系为导向，药物在治疗某一病症时是一个有机的整体，不能将主要成分与其药效成分相混淆，更不能笼统地认为其中所有化学成分都发挥治疗作用，而要结合油茶枯饼的抗血栓作用进行“药学-药效”关联质量分析[13-16]。首先，本研究确定了油茶枯饼的有效部位、有效成分群，通过比较各种制备物形式间的出膏率、指标成分含量及相对比例，得出油茶枯饼抗血栓药效的最佳制备物是油茶枯饼富集物。在药效指导下制备油茶枯饼药物制备物，首先要保证药物体系的完整性，其次要提高有效指标性成分的含量，并对各成分间的比例进行优化，才能大幅提高药效。因此，本研究对得到油茶枯饼优质药物制备物具有一定的参考价值。

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Drug Quality Characterization Consideration of Preparations of Oil Tea Camellia Defatted Cake based onAntithrombotic Effect

Wang Yali1,Zhang Xiaoqian2,Li Linfu1,Wu Qiuhong1,Lu Dongbo1,Li Wenxia1,Shi Renbing1,3
(1.Key Unit of Exploring Effective Substances of Classical and Famous Formulas of the State Administration of Traditional Chinese Medicine,School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102,China;2.Beijing Institute for Drug Control,Beijing 102206,China; 3.Quality Control Technology and Engineering Center of Chinese Medicine,Beijing Municipal C ommission of Education Beijing 100102,China)

This study was aimed to select the best preparation form of medicinal in camellia cake,based on the optimal antithrombotic agents in oil tea camellia defatted cake to establish the foundation of research.The content of effective index component of the oil tea camellia defatted cake preparation was detected by HPLC-PDA.The quality of medicinal preparation from oil tea camellia defatted cake was characterized based on the content,relative quantity,relative ratio of content,yield rate and antithrombotic effect.The results showed that the effect of antithrombotic of three medicinal preparations from oil tea camellia defatted cake was listed in the following descending order of enrichment,ethanol extract,and water extract.The enrichment was the best preparation form of medicinal in oil tea camellia defatted cake preparation with the highest content of effective index components,the lowest extract rate and the lowest dosage.But it had the best effect of antithrombotic.It was concluded that the significant improvement of efficacy was due to the increase of the content of the components in the preparation and the rationality of the proportion.At the same time, analysis of component quality based on basic composition of drug system through the consideration of effective components of type and quantity,composition and other quality factors can further guide the preparation of drugs.

Oil tea camellia defatted cake,drug system,quality consideration,pharmacy-efficacy

10.11842/wst.2017.03.021

R284

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：王晶）

2017-01-15

修回日期：2017-02-26

＊北京中医药大学重点学科开放课题（2013-ZDXKKF-23）：中药特性化学，主持人：石任兵。

＊＊通讯作者：石任兵，博士，教授，博士生导师，主要研究方向：中药（复方）药效物质基础及药物创新研究。