云南中蜂蜂箱寄居节肢动物种类及中蜂囊状幼虫病病毒检测

宋文菲，梁 铖，苗春辉，张学文，罗卫庭，杨 爽,2*

(1.云南省农业科学院 蚕桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101； 2.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

云南中蜂蜂箱寄居节肢动物种类及中蜂囊状幼虫病病毒检测

宋文菲1，梁 铖1，苗春辉1，张学文1，罗卫庭1，杨 爽1,2*

(1.云南省农业科学院 蚕桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101； 2.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

为了解中蜂蜂箱内寄居节肢动物种类及其感染中蜂囊状幼虫病病毒的情况，采集中蜂箱内的主要寄居节肢动物，并利用RT-PCR技术对这些节肢动物样品进行CSBV带毒情况检测。结果显示，云南省中蜂蜂箱内主要的寄居节肢动物有7种，都不同程度地感染了CSBV，且平均感染率为68.57%。研究表明，中蜂蜂箱内节肢动物可成为CSBV的携带者，可将病毒传播给其他蜂群。

中蜂； 中蜂囊状幼虫病病毒； 蜂箱； 寄居节肢动物； 间接传播

中蜂囊状幼虫病简称中囊病，是由中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese Sacbrood Virus，CSBV)感染引起的肠道传染性疾病，发病快，传播迅速，严重影响了中蜂的生产。该病是中蜂的主要病害之一，一旦感染，很难治愈，死亡率高达60%～90%。疾病的传播方式是其扩大感染范围的有效途径，一般昆虫病毒性疾病的传播方式分为水平传播和垂直传播两种，近些年来，蜜蜂病毒性疾病的传播方式也被西方学者广泛研究，这些研究证实了蜜蜂病毒性疾病的传播方式也分为水平传播和垂直传播[1]。水平传播是指病毒在同一世代的蜜蜂个体中进行传播，可分为直接与间接两种，直接传播包括空气传播感染、食物传播感染、交尾传播感染；间接传播是指通过起媒介作用的生物宿主进行传播。垂直传播则是发生在亲代与子代间的传播，即可通过亲代的卵把病毒传播给子代。

蜂箱这个大环境里不仅住着蜜蜂，还住着许多其他的节肢动物，而这些节肢动物或多或少都会与蜜蜂及其食物接触，这一过程也为疾病的传播提供了途径和媒介。中囊病作为中蜂的主要病害之一，多年来一直是研究者研究的热点，但却没有找到一种行之有效的治愈方法。国外研究者研究了西蜂蜂箱内传播该病的生物媒介，针对中蜂蜂箱内的却鲜有报道。本文以云南中蜂蜂箱内的寄居节肢动物为研究材料，研究在中囊病高发季节蜂箱内节肢动物携带CSBV的情况，结果发现采集到的7种主要节肢动物均被检测到携带CSBV，表明中蜂箱内的寄居节肢动物可成为CSBV传播的生物媒介。本文研究结果为研究CSBV潜在的主要传播媒介提供前期基础，也为研究CSBV的流行病学提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集

样品采集时间为中囊病高发的春繁季节，时间为2015年3—4月。采集地点为云南省楚雄州武定县、红河州蒙自市、西双版纳州勐海县、曲靖市罗平县。蜂箱包括木制和水泥制2种。采集的样品保存在-80 ℃。

1.2 总RNA提取

参照许益鹏等[2]的方法，并加以改进。具体步骤如下：每群取5只样品(蟑螂、蚰蜒、衣鱼等个体较大的虫体，需将虫体用灭菌手术剪剪成3～4段，每段为1个样品进行检测)，取1只置于1.5 mL离心管内，加入1 mL Trizol，用玻璃研棒充分匀浆，静置5 min；加入200 μL氯仿，充分震荡，静置2 min；4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min；取上清液400～600 μL，加氯仿200 μL，混匀静置5 min；4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min；取上清液200～300 μL，加入等量的异丙醇，混匀，静置10 min；4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min；沉淀以75%乙醇洗；4 ℃，12 000 r·min-1离心5 min；倒去乙醇，真空抽干，用40 μL DEPC处理水溶解，-80 ℃保存备用。

1.3 RT-PCR扩增

2 结果与分析

2.1 蜂箱内昆虫种类

经调查发现，蜂箱内有蜡螟、蚂蚁1(一种大蚂蚁)、蚂蚁2(一种小的黄色蚂蚁)、蟑螂、衣鱼、疑似黑粉甲(Alphitobiusdiaperinus，Panzer，1796)的小甲虫、蚰蜒(图1～2)。

图2 水泥制中蜂蜂箱内3种主要寄居节肢动物

2.2 RT-PCR扩增结果

部分昆虫的RT-PCR扩增结果如图3～4所示，目的片段为487 bp。图3中泳道1～3为蟑螂样品，4和10为蚂蚁1样品，5～9为蜡螟样品。图4中泳道1～5为衣鱼样品，6为蜡螟样品，泳道7～11为蚰蜒样品，12为蜡螟样品。检测结果显示，被检测的蟑螂、蜡螟、衣鱼、蚰蜒、蚂蚁1样品都不同程度的感染了CSBV。

2.3 节肢动物感染CSBV情况

中蜂蜂箱内寄居节肢动物感染CSBV的情况见表1，7种节肢动物都不同程度地感染了CSBV，平均感染率为68.57%。

表1 中蜂蜂箱内寄居节肢动物感染CSBV情况

昆虫名称感染率/%采集地区衣鱼100曲靖市罗平县蚰蜒40曲靖市罗平县蜡螟20蒙自市草坝镇蟑螂40蒙自市草坝镇蚂蚁1100蒙自市草坝镇蚂蚁280曲靖市罗平县疑似黑粉甲100楚雄州武定县

1～3为蟑螂样品，4、10为蚂蚁1样品，5～9为蜡螟样品；M为DL1 000 Marker; 泳道3～4感染CSBV(487 bp)，泳道1～2和5未感染；泳道7、10感染CSBV(487 bp)，泳道6、8～9未感染图3 蟑螂、蚂蚁1、蜡螟样品感染CSBV情况

1～5为衣鱼样品，4、6、12为蜡螟样品，7～11为蚰蜒样品；M为DL1 000 Marker; 泳道1～5感染CSBV(487 bp)，泳道6未感染；泳道10～11感染CSBV(487 bp)，泳道7～9、12未感染图4 衣鱼、蚰蜒、蜡螟样品感染CSBV的情况

3 讨论

宿主的成功传毒依赖于获毒、持毒、病毒稳定性、病毒释放等几个环节。病毒性疾病的传播方式一直是研究者研究防治该种疾病的一个重要方面。德国和希腊的研究者在20世纪80年代对蜜蜂病毒性疾病的水平传播方式进行了初步研究发现，患有蜜蜂囊状幼虫病的西蜂群中也严重感染了大蜂螨，推测病毒的流行与大蜂螨的发生紧密相联，认为蜂螨能够携带蜜蜂囊状幼虫病病毒 (Sacbrood bee virus，SBV)，并将病毒传播给中蜂蜂群。蜂螨作为一种潜在的蜜蜂病毒携带者，病毒可在其体内复制[4-5]，被其浸入到蜜蜂血淋巴里，造成蜜蜂免疫抑制，同时也影响着蜜蜂体内的营养状态[6]。2001—2003年，在瓦螨暴发的新西兰蜜蜂群中就检测到包括SBV在内的5种蜜蜂病毒[7]。研究发现，除了蜂螨，蜂巢内的其他寄生虫，如蚂蚁、小蜂巢甲虫、壁虱等也是蜜蜂病毒的携带者[8-10]。本文的研究结果与前人的研究结果相符[11]，发现中蜂箱内的7种主要寄居节肢动物在CSBV高发季节都是CSBV的携带者，表明CSBV的传播不单纯是蜂群内部的食物或饲喂接触传播，与蜂群共同生活的节肢动物也是该病毒的潜在传播媒介。

我国是蜜蜂疾病流行与暴发最为严重的地区之一，每年因疾病流行损失大量饲养蜂群，疾病的广泛传播成为我国蜜蜂生物多样性快速下降的一个主要因素[12]。目前，对中囊病防控措施的研究报道多局限在发病后，采取药物、加强饲养管理、换王断子等综合防治措施，但效果一般，而从病毒的传播途径角度寻找解决方法的研究，却鲜有报道。虽然国外研究者对包括SBV在内的多种蜜蜂病毒的传播方式及潜在的生物传播媒介进行了大量的研究，但CSBV与SBV是2个独立的病毒株。研究表明，同一病毒种的不同病毒株的传播方式特性也是不尽相同的[13]，且中蜂和意蜂又是两种完全不同的蜂种。因此，有必要对中蜂蜂箱内CSBV的传播媒介进行研究，为培育抗病中蜂良种提供前期基础。

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(责任编辑：张瑞麟)

2017-03-20

国家现代农业产业技术体系(蜜蜂)(CARS-45-SYZ 17)；云南省农业科学院基础性超前预研项目(2014CZJC014)；国家自然科学基金应急管理项目(31640080)

宋文菲(1983—)，女，吉林蛟河人，助理研究员，硕士，从事蜜蜂病害防治及良种选育研究工作，E-mail: wenfeisong@126.com。

杨 爽，从事中蜂病虫害研究工作，E-mail: yangshuang19860724@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170544

S896.1

A

0528-9017(2017)05-0861-03

文献[3]中SBV片段SB1-2引物SBV-F(5′-ACCAACCGATTCCTCAGTAG-3′)，SBV-R (5′-CCTTGGAACTCTGCTGTGTA-3′)。RT-PCR反应体系为：20 μL体系中含有RNase Free dH2O 8.7 μL，MgCl2(25 mmol·L-1) 4 μL，10×One Step RNA PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1) 2 μL，RNase Inhibitor(40 U·μL-1) 0.3 μL, AMV Reverse Transcriptase XL(5 U·μL-1) 0.3 μL，AMV-Optimized Tap (5 U·μL-1) 0.3 μL，上下游引物各0.8 μL，总RNA 0.8 μL。反应条件：50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，4 ℃保存。取PCR产物5 μL用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

文献著录格式：宋文菲，梁铖，苗春辉，等. 云南中蜂蜂箱寄居节肢动物种类及中蜂囊状幼虫病病毒检测[J].浙江农业科学，2017，58(5)：861-864.