当归炭疽病菌的生物学特性研究

杨成德，卞静,陈泰祥,陈秀蓉*,王涵琦,杨小利，王艳



当归炭疽病菌的生物学特性研究

杨成德1，卞静1,陈泰祥1,陈秀蓉1*,王涵琦1,杨小利1，王艳2

(1.甘肃农业大学植物保护学院,甘肃 兰州 730070;2.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000)

本试验利用常规方法研究了当归炭疽病菌(束状炭疽菌Colletotrichumdematium)的生物学特性和营养利用能力，为明确当归炭疽病的发生流行规律提供了依据。结果表明，菌落生长和孢子萌发最低温度和最高温度为10 ℃到35 ℃，最适为25 ℃；在pH 5～11间菌落可以生长，最适pH为11；在pH 8～11间产孢，最适pH为10，但中性有利于孢子萌发；该菌对碳氮源利用范围广，但甘露糖、D-半乳糖和氯醛糖抑制其生长；菌落生长和孢子萌发对光照不敏感；相对湿度95%以上分生孢子能萌发，水中萌发率显著高于其他湿度条件(P<0.05)，蔗糖能够促进孢子的萌发，但马铃薯汁液抑制其萌发。

当归炭疽病菌；生物学特性；碳源；氮源

当归(Angelicasinensis)为伞形花科多年生高山草本植物，是我国常用中药材，其主要化学成分对机体的造血系统、循环系统、神经系统和免疫系统等多个系统具有药理作用[1]，有补血、活血、调经、润燥等多种功效[2]，不仅大量用于传统中药配方，而且是许多中成药的重要原料和传统出口商品。当归喜凉爽、湿润气候，国内主要分布于甘肃、陕西、云南、四川和青海等海拔 1800～3000 m 山区种植[3]，尤以甘肃产量最大，但随着种植面积的扩大以及种植年限的增长，田间炭疽病等病原菌逐年积累，造成当归病害发病严重，影响当归的品质和产量。目前国内已报道的栽培当归病害主要有褐斑病(Septoriasp.)、腐烂茎线虫病(Ditylenchusdestructor)、白粉病(Erysipheheraclei)、根腐病(Fusariumavenaceum)及水烂病等[4-7]，但野生当归没有发现病害[8]。当归炭疽病为2012年调查发现的当归新病害，在甘肃省岷县、渭源和漳县等地普遍发生[9]，但仅对该病症状和病原等进行了报道。本研究进一步对其病原生物学特性和碳氮源利用能力进行了测定，以期为该病害的发生流行规律深入研究及田间综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试病原菌 当归炭疽病菌束状炭疽菌(Colletotrichumdematium)由甘肃农业大学植物病理实验室保存。

1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和察氏培养基参考文献[10]配制。当归汁液培养基参考文献[9]配制。

1.2 试验方法

1.2.1 不同培养条件对菌落生长的影响 (1)温度对菌落生长的影响，设5、10、15、20、25、30、35和40 ℃，共8个温度条件。将病原菌活化培养后用6 mm直径的打孔器打取菌饼，将菌饼接种到当归浸汁液培养基上黑暗培养，观察菌落生长情况，3 d后用十字交叉法每天测量菌落大小，直至生长最快的温度满皿，15 d后测定产孢量[11]。

(2)pH对菌落生长的影响，将当归浸汁液培养基高温灭菌后，用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH溶液在无菌条件下将培养基pH值调成4、5、6、7、8、9、10、11和12共9个梯度，将菌饼分别接种到这9种培养基上，25 ℃下黑暗培养，其他同1.2.1中(1)。

(3)碳源对菌落生长的影响，用察氏培养基作为基础培养基，以葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、氯醛糖为碳源，以不加碳源的察氏培养基为对照，制成12种培养基，将菌饼接种在各种培养基平板上[12-13]，25 ℃下黑暗培养，其他同1.2.1中(1)。

(4)氮源对菌落生长的影响，用察氏培养基作为基础培养基，以蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、硝酸铵、牛肉膏、硫酸铵、酵母浸粉、磷酸二氢铵、硝酸钠、L-亮氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、氯化铵、甘氨酸和碳酸铵为氮源，以不加氮源的察氏培养基为对照，制成16种培养基，将菌饼接种在各种培养基平板上[12-13]，25 ℃下黑暗培养，其他同1.2.1中(1)。

(5)光照条件对菌落生长的影响，将菌饼接种到当归浸汁液培养基上，分别置于全光照和全黑暗的条件下，25 ℃下培养，其他同1.2.1中(1)。

1.2.2 不同培养条件对孢子萌发的影响 将保存的菌株接种到当归浸汁液平板培养基上，于25 ℃下培养15 d，收集分生孢子进行以下试验。

(1)温度对孢子萌发的影响，设5、10、15、20、25、30、35和40 ℃，共8个温度条件。将病原菌的分生孢子用无菌水配制成孢子悬浮液，悬滴法制片，3次重复，每2 h观察1次，每个视野选择100个孢子，记录萌发率[13]。

(2)湿度对孢子萌发的影响，设100%，95%，90%，80%，70%，60%和50%，共7个相对湿度，在干燥器内用硫酸法控制湿度，将孢子粉撒于载玻片上，在25 ℃下培养，以蒸馏水中孢子萌发率为对照(CK)[13]，其他同1.2.2中(1)。

(3)pH值对孢子萌发的影响，设4.53、5.59、6.47、7.38、8.34和9.18[13]，共6个pH条件。用不同pH值的磷酸缓冲液配制成孢子悬浮液，悬滴法制片，3次重复，置于25 ℃下培养，其他同1.2.2中(1)。

(4)营养液对孢子萌发的影响，配制当归汁液、当归汁液加蔗糖溶液、蔗糖液和马铃薯汁液4种营养液，每种营养液3个浓度梯度，溶质∶水分别为1∶5、1∶10和1∶20。用不同营养液配制孢子悬浮液，悬滴法制片，3次重复，置于25 ℃下；以清水配制孢子悬浮液为对照；其他同1.2.2中(1)。

(5)光照条件对孢子萌发的影响，将病原菌的分生孢子用无菌水配制成孢子悬浮液，悬滴法制片，3次重复，分别置于全光照和全黑暗的条件下，其他同1.2.2中(1)。

图1 温度对菌落生长的影响Fig.1 The influence of temperature on colony growth标不同字母者在0.05水平差异显著。下同。The different letters indicate significant diference at P<0.05.The same below.

图2 pH对菌落生长的影响Fig.2 The influence of pH on colony growth

图3 碳源对菌丝生长的影响Fig.3 The influence of carbon sources on hyphal growth1:葡萄糖Glucose;2:蔗糖Sucrose;3:乳糖Lactose;4:麦芽糖Maltose;5:甘露醇Mannitol;6:甘露糖Inannose;7:D-阿拉伯糖D-arabia sugar;8:D-木糖D-xylose;9:D-半乳糖D-galactose;10:氯醛糖Chloralose puriss;11:对照CK.

2 结果与分析

2.1 不同培养条件对菌落生长的影响

2.1.1 温度对菌落生长及产孢量的影响 试验结果(图1)表明，当归炭疽病菌在10～35 ℃下均能够生长，其最适温度为25 ℃，在5和40 ℃下则不能生长。在20和 25 ℃下可产孢，产孢量分别为26.1×107和2.8×107，其余温度条件下不产孢。

2.1.2 pH对菌落生长及产孢量的影响 试验结果(图2)表明，当归炭疽病菌菌落在pH值为5～12之间均能够生长，pH 11为其最适生长酸碱度，当pH为4时基本不能生长；菌落生长速率与pH大小成正比，碱性条件更有利于其菌丝的生长，但当pH达到12时菌落生长率显著降低。在pH 8～11能够产生孢子，产孢量分别为0.35×106、0.85×106、13.30×107和1.20×106，pH 10时产孢量最大。

2.1.3 碳源对菌落生长的影响 试验结果(图3)表明，在葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、D-阿拉伯糖培养基上菌落生长显著高于对照(P<0.05)，说明该菌能够较好利用；在甘露糖、D-半乳糖和氯醛糖培养基上菌落生长显著低于对照(P<0.05)，说明甘露糖、D-半乳糖和氯醛糖是其不良碳源。

2.1.4 氮源对菌落生长的影响 试验结果表明，在供试的15种氮源培养基上，当归炭疽病菌菌落生长速率显著高于对照(P<0.05)，表明该菌对氮源的利用范围非常广泛(图4)。

2.1.5 光照条件对菌落生长及产孢量的影响 试验结果表明，当归炭疽病菌在光照和黑暗条件下菌落生长差异不显著，即菌落生长不受光照影响，但光照条件下不产生孢子，黑暗条件下产孢子量为2.8×106。

2.2 不同培养条件对孢子萌发的影响

2.2.1 温度对孢子萌发的影响 试验结果(图5)表明，当归炭疽病菌在5和40 ℃下不萌发，在10～35 ℃下均能萌发，但在35 ℃下萌发率为8%，在10 ℃下的萌发率达21%，说明其对低温的适应能力略高于对高温的适应能力。15～30 ℃条件下萌发率较高，其中25 ℃为其萌发的最适温度，20和30 ℃之间无明显差异。

图4 氮源对菌丝生长的影响Fig.4 The influence of nitrogen sources on hyphal growth1:蛋白胨Peptone;2:大豆蛋白胨Soybean peptone;3:尿素Urea;4:硝酸铵Ammonium nitirate:5:牛肉膏 Beef extract；6：硫酸铵Ammonium sulfate;7：酵母浸粉Beef extract powder；8：磷酸二氢铵Ammonium dihydrogen phosphate；9:硝酸钠Sodium nitirate;10:L-亮氨酸L-leucine;11:L-精氨酸L-arginine;12:L-组氨酸L-histidine;13:氯化铵Ammonium chloride;14:甘氨酸Glycine;15:碳酸铵Ammonium carbonate；16：对照 CK.

2.2.2 湿度对孢子萌发的影响 试验结果表明，当相对湿度低于95%时孢子不萌发，在湿度达到95%和100%时，12 h后萌发率仅4%和10%，而在水中(CK)萌发率达85%。

2.2.3 pH对孢子萌发的影响 试验结果表明，当归炭疽病菌对酸碱度的适应范围较广，在pH 4.53～9.18之间均能萌发。在6.47～8.34间萌发率最高，强碱性和强酸性条件不利于孢子的萌发(图6)。

2.2.4 营养液对孢子萌发的影响 试验结果表明，当归炭疽病菌在4种营养液中均能够萌发，且不同营养液和同种营养液的不同浓度对孢子萌发的影响差异性显著，但只有蔗糖溶液能够促进孢子的萌发，且萌发率与蔗糖溶液的浓度成正比(表1)。

2.2.5 光照条件对孢子萌发的影响 在全光照和全黑暗条件下培养的分生孢子萌发率差异不显著，14 h后分别为82%和86%，说明当归炭疽病菌的分生孢子对光照不敏感。

表1 营养液对孢子萌发的影响Table 1 The effect of nutrition solution on conidial germination %

注：同营养液不同比例间标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图5 温度对孢子萌发的影响Fig.5 The effect of temperature on conidial germination

Note:The different proportion of nutrient solution with different letters indicate significant difference atP<0.05.

图6 pH对孢子萌发的影响Fig.6 The effect of pH value on conidial germination

3 结论与讨论

炭疽病为植物上一类重要病害，在马铃薯(Solanumtuberosum)[14]、红掌(Anthuriumandraeanum)[15]和大豆(Glycinemax)[16]等植物上均有报道，但由束状炭疽菌引起的当归炭疽病为国内新病害[9]，该病原菌菌丝生长的最适温度为25 ℃，低于火龙果(Hylocereusundulatus)炭疽病原菌的30 ℃[17]、油茶(Camelliaoleifera)炭疽病菌的28 ℃[18]和无花果(Ficuscarica)炭疽病菌的25～30 ℃[19]，但与南繁区棉花(Gossypiumspp.)炭疽病菌[20]及枸杞(Lyciumchinense)炭疽病菌[20]的最适温度相一致；在pH 5～11之间均能够生长，最适pH为11，但在pH 8～11之间才能产孢，且产孢的最适pH为10，其显著高于其他炭疽菌[17-21]，该特点是否与寄生当归后的适应性有关还需进一步研究；该菌对碳氮源的利用范围非常广，但甘露糖、D-半乳糖和氯醛糖抑制其生长，在综合防治中有参考价值；该菌的菌丝生长和孢子萌发均不受光照和黑暗条件下的影响，与马铃薯炭疽菌一致[14]。孢子萌发的最适温度为25 ℃，在5和40 ℃下则不萌发，与马铃薯炭疽菌一致[14]，但孢子对湿度要求极高，需在液态水中才能萌发；中性至偏碱性和酸性条件下有较高的萌发率，与火龙果炭疽菌[17]和马铃薯炭疽菌[14]一致；高浓度的蔗糖溶液能够促进孢子的萌发，但高浓度的马铃薯溶液可以抑制其萌发。根据对束状炭疽菌生物学特性研究结果表明，当归栽培的土壤条件应当选择排水良好、疏松肥沃、腐殖质丰富的砂质土壤，避免因积水造成湿度过大有利于孢子萌发和侵染而加重病害的为害程度；另外，要避免过度密植，改善通风透光条件，降低湿度；第三，虽然酸性条件有利于孢子萌发，但不利于菌落生长，特别不利于产孢，可能酸性土壤种植当归有利于炭疽病的控制；第四，前荐种植马铃薯可能不利于病害的发生。本研究对当归炭疽病病原菌束状炭疽菌的生物学特性进行了研究，为当归炭疽病的发生规律和综合防治提供了一定的理论依据，但该病具体的田间防治方法还需进一步研究。

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Biological characteristics of theAngelicasinensisanthracnose causal agent,Colletotrichumdematium

YANG Cheng-De1,BIAN Jing1,CHEN Tai-Xiang1,CHEN Xiu-Rong1*,WANG Han-Qi1,YANG Xiao-Li1,WANG Yang2

1.CollegeofPlantProtection,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China

The biological characteristics and substrate requirements ofColletotrichumdematiumwere studied using traditional culture techniques to provide a basis for understanding the occurrence of outbreaks ofAngelicasinensisanthracnose.It was found that the temperature range over which mycelium growth and conidial germination ofC.dematiumoccurred was from 10 ℃ to 35 ℃,with an optimum temperature of 25 ℃.Mycelium growth occurred from pH 5 to pH 12,and the optimum pH value was 11.Conidia were produced from pH 8 to pH 11,and the optimum pH value for conidia production was 10,while the optimum for conidial germination was pH 7.The mycelium ofC.dematiumgrew best on media with more abundant carbon and nitrogen supply,but were inhibited by mannitol,D-galactose and chloralose.Mycelium growth and conidial germination were not sensitive to light.Conidia required a relative humidity of 95% or more for germination,and liquid water was the most suitable medium for conidial germination (P<0.05).Sucrose solution promoted conidial germination,but potato solution inhibited germination.

Colletotrichumdematium;biological characteristics；carbon source;nitrogen source

10.11686/cyxb2016295 http://cyxb.lzu.edu.cn

杨成德,卞静,陈泰祥,陈秀蓉,王涵琦,杨小利,王艳.当归炭疽病菌的生物学特性研究.草业学报,2017,26(6):139-144.

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2016-08-17；改回日期：2016-10-19

甘肃农业大学自列项目(GSAU-ZL-2015-014)资助。

杨成德(1975-)，男，甘肃武都人，教授，博士。E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

*通信作者Corresponding author.E-mail:chenxiurong@gsau.edu.cn