猪精液稀释液室温贮存时间效果研究

陶 剑，陈预明，曹亚鸽，孟 立，卫恒习，李 莉，张守全

（1.华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广东 广州 510642；2.广东广三保养猪有限公司，广东 广州 510642）

猪精液稀释液室温贮存时间效果研究

陶 剑1，陈预明2，曹亚鸽1，孟 立1，卫恒习1，李 莉1，张守全1

（1.华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广东 广州 510642；2.广东广三保养猪有限公司，广东 广州 510642）

为解决因水质所致的猪精液稀释液效果不稳定的问题，试验选用实验室研制的配方A和公开 BTS 两个配方配制成液态稀释液，过滤除菌，室温过夏天贮存后与某商业用的液态稀释液（液态 B）做对照，观察 3 种液态稀释液室温贮存时间对精子活力和生存指数的影响。结果表明，BTS、配方 A 液态室温贮存 396 d 用于稀释猪精液，保存第 3 天精子活力和生存指数分别为 0.85、0.75和 40.80、39.60，优于液态 B 的 0.2 和 24.60，仍能满足人工授精精子活力的要求。因此，BTS 和配方A液态精液稀释液可以推广应用，液态室温贮存保持期可达1年。

猪精液；稀释液；室温贮存；保存效果

猪人工授精技术自从 1932 年试验成功后，便迅速得到了广泛的推广应用。猪人工授精技术可以大幅度减少公猪的饲养，提高优秀公猪的配种效率，减少疾病传播，降低饲养成本。而猪精液的保存品质是决定人工授精成功与否的重要因素之一。按照保存温度的不同，猪精液的保存分为冷冻保存（-196 ℃）、低温保存（5 ℃）、常温保存（17 ℃）3 种，其中常温保存具有方便快捷、技术要求简单、成本低廉、保存效果好、活力高、对精子损伤小、受胎率高、窝产仔数高等优点，易于推广普及，在猪人工授精中99%以上是采用常温保存的精液进行输精的[1]。在猪精液的常温保存中，精子的活力受到环境温度、pH、渗透压、营养物质、稀释倍数、代谢废物、细菌的繁殖生长等诸多因素影响。而精液稀释液不仅能为精子提供代谢所需的能量、pH 和渗透压，还可以抑制精子活力和精液中微生物的繁殖，缓冲精子和细菌的代谢废物，起到保护精子、延长有效保存时间的作用[2]。

我国稀释粉市场中国产稀释粉所占的市场份额仅为 5%，而进口稀释粉的份额占到了 95%[3]。国产猪精液稀释粉价格低廉，但大多数存在保存时间短、输精效果差的缺点[4]；而且由于猪品种、配 方和 地 域的差异，稀释粉更表现出不稳定的应用效果[5]。而进口稀释粉存在价格昂贵、种类繁杂、鱼龙混杂、使用不便等问题，在一定程度上阻碍了我国猪人工授精技术的推广应用，因而亟待研发出具有中国自主知识产权、质量可靠的猪精液稀释粉。

本研究选用 BTS 和配方 A 两个稀释液配方，采用实验室自制的超纯水配制成液态形式，过滤除菌室温下贮存一段时间后用于精液常温保存试验，以探索稀释液室温下的贮存效果。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于 2014 年 9 月至 2015 年 12 月在广东广三保畜牧有限公司开平分公司进行。

1.2 材料

1.2.1 试剂 无水葡萄糖、柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠（NaHCO3）、EDTA、Tris、Hepes、氯 化 钾（KCl），均 由Sigma 公司生产，青霉素钠由华北制药股份有限公司生产，硫酸链霉素由深圳华药南方制药有限公司生产。1.2.2 仪 器 0.45 μm 微孔滤 膜 、0.22 μm 微孔 滤膜、过滤器、高温高压灭菌锅、恒温水浴锅、17 ℃冰箱、显微镜、纯水仪。

1.3 方法

1.3.1 液态稀释液的配制 实验室研制的配方 A和公开配方 BTS 的配制：准确称量试剂，加入 1 L 实验室自制的超纯水，用磁力搅器搅拌使之充分溶解，配制成液态形式。在超净工作台中利用经过高温高压灭菌的过滤器过滤除菌，密封后室温贮存备用。商业用的进口稀释液（液态 B）在市场上购买。

1.3.2 精液采集 选取体型健美的优秀杜洛克种公猪采用手握法采集全份精液，用滤纸过滤去除胶状物后保存于保温杯中，30min 内送达实验室。初步检测精液品质，选取精子活力大于 0.8、无异味且乳白色的精液进行试验研究。精液均分为 3 份，按相同比例进行等温稀释，密度为 3×107～5×107个/mL，分装到输精瓶中，待温度降到常温后用干毛巾包裹置于 17 ℃恒温箱中保存，每隔 12 h 翻动输精瓶 1 次，以防精子凝集沉淀。

1.4 精子活力和生存指数的检测

每隔 24 h，从输精瓶中吸取 50 μL 稀释精液于载玻片上，盖上盖玻片，升温到 37 ℃，400 倍显微镜下观察。每次至少选取4个视野观测直线运动精子数量，采用十级评定法计算精子活力和生存指数。

活力：直线运动精子占总精子数的百分率。

生存指数=∑（上次活力+下次活力）/2×时间间隔。

2 结果与分析

2.1 不同常温稀释液对精子活力的影响

不同常温稀释液对精子活力的影响结果详见表1。BTS 和配方 A 稀释液室温贮存 396 d 后进行精液保存试验，保存第 3 天精子活力仍然还能达到 0.85和 0.75，满足生产使用的要求；而对照组液态 B 室温贮存 201 d 时常温保存第 3 天精子活力为 0.65，随后的试验数据表明其保存效果逐步下降，贮存 396 d后进行精液保存试验，保存第 3 天精子活力仅为0.2。

表1 3 种配方稀释液液态室温贮存时间对猪精子活力的影响（n=1）

2.2 不同常温稀释液对精子生存指数的影响

如表2所示，BTS和配方A的生存指数比较稳定，全程稳定维持在 40 左右，且 BTS 略高于配方 A。而液态 B 室温贮存的保质期在 200 d 左右，200 d 以后生存指数直线下降，到 396 d 时生存指数仅约为 25。液态 B的试验结果与包装袋上述6个月的保质期基本一致。

表2 3 种配方稀释液液态室温贮存时间对猪精子生存指数的影响（n=1）

3 讨论

3.1 水质对猪精液常温保存的影响

在猪精液常温保存过程中水质对精子的活力有很大的影响[6]。生产中，所采用的稀释用水主要是取自猪场附近水源进行蒸馏或商业饮用蒸馏水，也有直接使用高山天然矿泉水、井水等，甚至有的直接使用自来水进行稀释。有研究发现，无污染、水质好的高山矿泉水和质量好的蒸馏水作稀释用水精子存活时间最长[7]。由于受到猪场的 污染或者附近农村使用化肥农药的影响，以及农村和城市的生活污水、工厂的废水等的污染，在制备双蒸水的时候可能会有部分挥发性的有毒物质经过蒸发、冷凝融入双蒸水中，影响蒸馏水水质，从而在精液稀释时会影响精子的存活时间。而且有些基层人员在制取、运输、保存双蒸水的过程中操作不当，也容易导致双蒸水受到污染，最终影响精液的正常使用，降低受胎率和产仔数。试验中两个自配的常温猪精液稀释液采用实验室自制的超纯水，水质较好，这可能是猪精液保存效果较好的原因之一。

3.2 糖类对猪精液常温保存的影响

精子维持正常的细胞代谢和运动需要能量，葡萄糖在绝大多数的配方中是为精子提供能量的，精子的产能主要是通过糖酵解途径进行的[8-9]，因此，常在精液稀释液中加入糖类以维持精子的生存。糖类不仅可以为精子的运动提供能量，还可以在精子周围置换水分子，形成保护膜，提高精子对渗透压的耐受能力[10]。苏泽智等[11]认为，海藻糖可以通过其羟基和精子细胞膜上的磷酸根结合，形成保护膜进而保护质膜。Maxwell等[12]认为，精液稀释液的渗透压主要靠非离子物质维持，离子对渗透压维持没有太大作用。因此也常用糖类来调节稀释液的渗透压。但是，糖类的含量不宜过高，否则对精子有损伤，影响受精率，因此传统的高糖配方（5%糖类）可能并不利于精子的长期保存。研究表明，低糖稀释液对精子的保存效果显著优于高糖稀释液，较高的糖类浓度会损伤精子的顶体[13]。Althouse 等[14]认为，稀释液中的葡萄糖在常温保存下会促进大部分革兰氏阴性菌的生长，进而导致精子活力下降、精子凝集、顶体肿胀等。周歧生等[15]认为，蜜糖具有抗菌效果，同时含有果糖、蔗糖、葡萄糖等营养成分更利于精子的保存。3.3 缓冲剂对猪精液常温保存的影响

精液稀释液中含有丰富的营养物质，利于微生物的生长、繁殖，可能会产生大量的代谢废物刺激精子，导致精子死亡。而精液保存的环境无氧，精子通过糖酵解途径产生大量的乳酸，随着保存时间的延长，精子代谢活动产生的酸性物质积累，达到一定程度 就 会 引 起 精 子 的 代 谢 性 酸 中 毒 死 亡[6]，而 精 清 中也含有一些影响精子保存的物质，降低浓度或去除更有利于精子的保存[16]。高飞等[9]认为，高浓度的钙离子（Ca2+）可以启动精子获能，对受精是很有必要的，但却不利于精子的保存。因此，在稀释液中加入一定量的缓冲剂是很有必要的。常用的缓冲剂有柠檬酸、柠檬酸钠、碳酸氢钠等。张宝珣等[1]认为，Hepes和 Mops等两性有机缓冲剂的缓冲能力要好于无机物，并且具有螯合有害金属离子的作用。但在本试验中并没能很好地体现出 Hepes的缓冲效果，可能是其添加量不足所致。常用的有机缓冲剂还有诸如Tris、BSA 等。有研究表明，适当的添加 BSA 可以稳定精子结构，维持精子的运动[17]，克服冷却过程中产生的溶血磷脂和自由脂肪酸造成的 Ca2+易进入胞内的性质[18]，对抗自由基对精子的 损伤 ，降 低 丙 二 醛（MDA）浓度[19]，中和精子和细菌代谢副产物[12]，减少精子头对头凝集[16]。而钾离子（K+）可以维持精子膜上 Na+-K+泵运转，适当添 加氯化钾（KCl）可防止精子耗竭 K+而丧失运动能力[20]，BTS 配方效果优于配方 A 可能是因为其中添加了 K+维持了精子的运动能力。

4 结论

本试验表明，BTS 和配方 A 的液态精液稀释液在室温下有较为良好的贮存效果，贮存 396 d 后用于精液稀释试验，保存第3天精子活力分别为0.85、0.75，符合保存 3 d 精子活力大于 0.6 的人工授精要求。因此，BTS 和配方 A 的液态精液稀释液可以推广应用，液态室温贮存保持期达1年。

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（编辑：富春妮）

观看条纹图案能引发偏头痛

【英国《每日电讯报》网站 5月 8日报道】荷兰和美国的科学家已经发现，对于某些人来说，仅仅注视垂直的条纹—无论是在静止的图案上还是在实际生活中—就可能触发大脑活动的神经回路。在某些案例中，这可能导致癫痫，而研究人员认为这还可能引起偏头痛。

有 1/7 的英国人患有偏头痛，而其病因常常无人知道。但是这篇论文的作者相信，服装、建筑物或公共美术作品上的条纹图案可能会引发严重的头痛，尤其是对于已经对光敏感的人们。

他们指出，露台装饰、暖气片、自动扶梯、造型重复的砖墙，甚至帆布篷或轻便折叠躺椅上的条纹，都可能引起疾病发作、癫痫，或者只是某种难以描述的不适感。

荷兰乌得勒支大学医学中心的多拉·赫尔梅斯说：“我们的研究结果意味着，在设计建筑物的时候，或许有必要避免那些可能激活这一回路并导致不适感、偏头痛或癫痫的视觉图案类型。甚至是完全健康的人，在看到那些最有可能引发光敏性癫痫发作的图案后，也可能会感到轻度的不适。”

众所周知，闪烁或明亮的灯光会引发癫痫发作或偏头痛。在 1997 年的一起事件中，一集《口袋妖怪》卡通片在日本导致 685 人癫痫发作。无独有偶，2012 年伦敦奥运会的一则广告在引发癫痫发作后不得不进行了修改，该广告画面展示的是泛着涟漪的彩色泳池中的一名跳水运动员。

但这是科学家首次发现某些静态图形也可能产生类似的影响。

在广泛查阅现有的科学文献后，研究人员认为，条纹图案影响人体的原因是它们会引发大脑内一种特定的重复性神经活动，即所谓的伽马振荡。条纹图案会导致强烈的伽马振荡，而出于科学家并不完全了解的原因，蓬松的云朵或自然景色一般不会导致伽马振荡。

研究人员发现，当他们对黑白条纹图案进行修改从而使垂直线条变得更宽，或者开始形成格子图案的时候，研究对象大脑中伽马振荡的活跃度出现了下降。

研究报告发表在《当代生物学》半月刊上。

（转自 参考消息[N]，2017-05-13）

Study on the Storage Tim e of Boar Semen Liquid Diluents at Room Tem perature

TAO Jian1,CHEN Yuming2,CAO Yage1,MENG Li1,WEIHengxi1,LILi1,ZHANG Shouquan1
（1.National Engineering Research Center For Breeding Swine Industry,Guangdong Provincial Key Laboratory of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding,College of Animal Science,South China Agricultural University, Guangzhou 510642,China;2.Guangdong Guangsanbao Co.,Ltd.,Guangzhou 510642,China)

In order to solve this problem due to the water quality,Diluent Formula A (DFA)and BTSmade in our own lab were used to extend semen samples,ofwhich the bacteria was filtered out,and then were preserved atambient temperature for the whole summer.A commercial extender(liquid B)was introduced as control group. Sperm motility and survival index were investigated among three different formulations of semen diluents.The results showed that after 396 d stored at ambient temperature,the DFA and BTS formula semen diluents diluted sperm can stillmeet the requirements of artificial insemination,and the sperm motility and survival index were 0.85,0.75 and 40.80,39.60 after 3 days,respectively,which was better than liquid B (0.2,24.60).Therefore, BTSand DFA semen dilution formula can be applied in production and constantly stored for one year in liquid.

boar semen;dilution;store at room temperature;save effect

S828

A

1002-1957(2017)03-0045-04

2017-05-08

广东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目（2016LM1102）

陶 剑（1992-），男，广西桂林人，在读硕士研究生，研究方向为生殖生理与生物技术.E-mail:1318389160@qq.com

张守全（1964-），教授，博士生导师，研究方向为生殖生理与生物技术.E-mail:sqzhang@scau.edu.cn