阳性神经元面积百分比和染色灰度相对强度值的结合在大鼠脑组织免疫组化图像定量分析中的应用*

曾志刚， 邱 红， 朱梅菊， 朱洪竹， 萧建华

(1. 井冈山大学体育学院， 2. 井冈山大学附属医院儿科， 江西吉安 343009)



阳性神经元面积百分比和染色灰度相对强度值的结合在大鼠脑组织免疫组化图像定量分析中的应用*

曾志刚1△， 邱 红1， 朱梅菊1， 朱洪竹1， 萧建华2

(1. 井冈山大学体育学院， 2. 井冈山大学附属医院儿科， 江西吉安 343009)

目的：通过下丘脑弓状核乙酰胆碱表达的检测、图像处理、图像分析，应用阳性神经元面积百分比(APPN)和染色灰度相对强度值(RISGL)相结合的方法，探讨免疫组化(IHC)图像定量分析的特点。方法：样本来源于运动性免疫抑制过程中SD大鼠下丘脑弓状核胆碱能阳性神经元乙酰胆碱表达的免疫组化切片，包括第0、2、4、6周与每周Control、Immediately after exercise、3 hours after exercise三组共计12组(n=6)。采用免疫组化技术测定其乙酰胆碱(ACh)的表达，并根据ACh阳性神经元总面积(TAPN)、阳性神经元灰度平均强度值(AISGL)、APPN、RISGL、APPN/RISGL参数进行免疫组化图像的定量分析, 从而比较APPN和RISGL在定量分析中与传统参数的不同及其优势。结果：APPN与TAPN的变化呈现几乎一致的变化特征，能发现相应差异的显著性意义(P<0.05)，但APPN的敏感性和抗干扰性更强。RISGL与AISGL呈现的结果并不完全一致，而且APPN结合RISGL比单参数更能反映阳性表达情况。结论：APPN和RISGL免疫组化图像分析参数能较可靠地、准确地进行图像定量分析，APPN与RISGL的结合不仅可反映阳性表达的数量情况，还可以帮助分析其作用机理，优于传统分析参数。

免疫组化；图像分析；面积；灰度；大鼠

由于计算机图像采集和分析技术的迅速发展，一些能对图像特征进行记录并量化分析的软件被开发出来，使应用计算机来代替人工对免疫组化图像进行精确的量化分析成为可能[1-3]。随着免疫组化图像处理软件的不断发展更新，它为免疫组化图像的定量分析提供了良好的计算机处理平台。但是对免疫组化结果的定量分析在追求更加准确与精确方面仍然存在诸多问题。如阳性神经元总面积(total area of positive neuron，TAPN)、阳性神经元灰度平均强度值(average intensity of staining grey level，AISGL)是目前使用比较多的免疫组化半定量分析参数[4]，但是均存在一些不足和/或局限。本研究以下丘脑弓状核(Arc)胆碱能阳性神经元在运动性免疫抑制过程中乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)表达的适应性变化为研究对象，探讨应用阳性神经元面积百分比(area percent of positive neuron，APPN)和染色灰度相对强度值(relative intensity of staining grey level，RISGL)及其相结合的方法进行免疫组化图像定量分析的特点和优势，为图像定量分析方法的改进提出一些建议和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

来源于运动性免疫抑制过程中SD大鼠下丘脑弓状核胆碱能阳性神经元乙酰胆碱表达的免疫组化切片，包括持续6周的递增负荷运动第0、2、4、6周(0 w、2 w、4 w、6 w)与每周安静(control, C)、运动后即刻(immediately after exercise, I)、3h组(3 hours after exercise, 3H)共12组切片(n=6)。

1.2 主要试剂和仪器

小鼠抗ACh单克隆抗体(CHEMICON，批号0603026247，工作浓度1∶400)，超敏聚合酶免疫组化检测试剂盒(CHEMICON，批号0603025758)，显色试剂盒(VECTOR，产品编号SK4800)；德国Leica全自动组织脱水机、石蜡包埋机、石蜡轮转切片机、摊片机、自动玻片盖片机、自动染色机、Leica QWin Plus V3.2.1高级图像处理软件，Motic B5光学显微镜、彩色数码CCD摄像头Moticam 1300。

1.3 取样与石蜡组织切片

大鼠经心脏灌注固定后，断头分离脑组织，4%多聚甲醛(pH 7.4，4℃)固定3 h后常规石蜡包埋[5]。对照文献[6]，选取耳间线嘴侧Interaural 6.72～6.96 mm间用Leica石蜡切片机进行连续冠状切片，切片厚5 μm。

1.4 免疫组织化学染色

常规脑组织切片脱蜡至水；切片泡在用pH 6.0的0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液配的0.1%TritonX-100里10 min，TBST洗3次×3 min；Peroxidase Blocking Solution封闭过氧化氢酶10 min，TBST洗3次×5 min；用微波修复，高火煮沸3 min，再低火维持10 min；5%正常山羊血清, 37℃孵育30 min；不洗，直接加一抗，37℃孵育1.5 h，TBST洗3次×10 min；加二抗，37℃孵育30 min，TBST洗3次×10 min；加新鲜配制的DAB显色剂，室温5～20 min，镜下控制，TBST洗3次×5 min；常规脱水透明，中性树脂封片[5]。空白对照：用TBST代替一抗进行同步免疫组织化学步骤，染色结果为阴性；阴性对照：用一抗同种属动物正常血清代替一抗进行同步免疫组织化学步骤，染色结果为阴性；阳性对照：用同切片自身的大脑皮质或海马回部位进行阳性对照，同步免疫组织化学步骤，染色结果为阳性。

1.5 图像采集与分析

1.5.1 图像采集与处理 运用Motic B5光学显微镜进行免疫组化切片进行观片和摄片。每次操作均严格遵守以下操作规程要点：开机预热20 min，保证光源稳定的前提下，400倍视野，设置Motic B5显微镜的光源为5.5～5.8之间，RGB设为1/0/14～15，所有设置一次性调整好后保持不变。为优化感兴趣区的阳性表达分析，图像分割采用HIS(色度、亮度、饱和度)代替RGB(红、绿、蓝)进行分割[7-9]，并且在选区内自动分割着色后进行多余部分的删除和缺失部分的补足，以达到选区内阳性表达的最佳选择(图1，见彩图页Ⅳ)：图1B红色实体箭头和黄色虚线箭头所示部位进行分割修正后达到图1A相应部位的效果，红色实体箭头部位进行了删除多余部分的处理，黄色虚线箭头部位进行了补充缺失部分的处理。

1.5.2 图像分析 运用Leica QWin Plus V3.2.1高级图象分析软件进行图像信息分析，主要参数为阳性神经元总面积、阳性神经元灰度平均强度值、APPN、RISGL、APPN/RISGL。APPN反映待测部位阳性神经元数量和细胞个体大小的综合状况，RISGL反映待测部位阳性神经元染色强度相对待测部位总染色强度的对比状况，RISGL结合APPN反映阳性神经元分泌物质表达的相对量。

APPN=选区内阳性神经元总面积(μm2)/选区总面积(μm2)×100%

阳性神经元总面积(TAPN)为选区内所有阳性神经元面积总和；选区总面积固定为(29 272.10-29 387.85)μm2。

RISGL=选区内阳性神经元灰度平均强度值/选区总灰度平均强度值

阳性神经元灰度平均强度值(AISGL)为选区内每个阳性神经元灰度平均强度值总和/选区内阳性神经元个数；选区总灰度平均强度值为选区内总体(含阳性神经元和背景染色)的灰度平均强度值。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 TAPN与APPN的比较

TAPN与APPN具有相似的变化，均显示I组中6 w比4 w非常明显地升高(P<0.01)，而I组中4 w比0 w的TAPN明显降低(P<0.05，图2)。图3E、H的箭头显示，与0 w比较，6 w的ACh表达范围出现扩散趋势(图3，见彩图页Ⅳ)。

2.2 AISGL与RISGL的比较

图2C、D显示，AISGL与RISGL呈现的结果并不完全一致，如2 w的ACh表达变化显示两种参数正好相反，AISGL显示在3H组中2 w与0 w、4 w、6 w比较ACh表达均明显升高(P<0.05)，但是RISGL显示ACh表达明显降低(P<0.05)；而且，AISGL其他组的0 w、4 w、6 w之间有一些变化具有显著性差异，而RISGL的其他组变化无显著性差异(图2)。由于背景染色的差异，上述两种参数在2周组的差异也可以从图3中可以直观发现(图3，见彩图页×)。

Fig. 2 Change of IHC parameters of ACh expression of hypothalamic arcuate nucleus cholinergic neurons in the process of exercise(n=6) IHC: immunohistochemistry; Ach: Acetylcholine*P<0.05,**P<0.01vs0 week;#P<0.05vs2 week

2.3 APPN与RISGL的结合

在APPN与RISGL单参数图中，在I组中ACh表达的APPN值4 w比0 w明显降低(P<0.05), 6 w比4 w明显升高(P<0.01)；在3H组中ACh表达的RISGL值2 w比0 w明显降低(P<0.05), 4 w比2 w明显升高(P<0.01), 6 w比2 w明显升高(P<0.01)。在APPN与RISGL结合的参数图中， I组中ACh表达的APPN/RISGL值6 w比4 w明显升高(P<0.01，图4)。

Fig. 4 Adaptive change of the combination of APPN and RISGL in hypothalamic arcuate nucleus(n=6) A, C, E: Adaptive change of APPN or RISGL; B, D, F: Adaptive change of APPN/RISGL*P<0.05,**P<0.01vs0 week;##P<0.001vs2 week;△△P<0.01vs4 week

3 讨论

APPN既可以反映待测部位阳性神经元数量，又可以反映阳性细胞个体大小的综合状况。由于一个视野的选区总面积相对固定，所以从图2A、B中可发现TAPN与APPN的变化呈现几乎一致的变化特征。APPN与TAPN一样，能发现相关差异的显著性意义。然而，可能APPN具有更高的敏感性，能避免阳性神经元面积百分比所受影响因素的干扰。而且，如果只考虑选区内阳性神经元的总面积，而没有考虑选区总面积的因素，则容易造成有针对性的挑选部分染色较好的小区域作为测试部位，从而增加可控制的人为的选择性误差。另外，由于目前免疫组化的各个步骤未量化和标准化，如DAB显色时间的长短、组织切片的厚度、拍摄图像时的光源亮度等因素，都可以对结果造成不同程度的影响。姜洋等学者提出的平均阳性染色面积百分比(APSAP)法的理论基础是阳性细胞的面积百分率，则上述因素不能对其结果造成显著的影响[1，9，10]，所以APPN参数方法同样也能很好的避免上述因素对结果的影响。但是，APPN对阳性表达出现面积增大和扩散(或面积减少和聚集)、阳性表达物新产生和被激活(或灭活和被抑制)等情况更具有实际意义。

采用RISGL来反映阳性神经元分泌的神经递质的表达量，它是指在选定区域内(同APPN一致)阳性神经元AISGL与此区域总的灰度平均强度的比值，参数RISGL比AISGL更好地平衡了染色背景的影响。本研究中如果不考虑选区总灰度平均强度值(主要包括背景强度)，可能由于背景染色过深或非特异性染色等原因，使阳性表达变化出现相反方向的偏差，而且即使变化方向相同，也可能出现差异显著性的不同。如结果2.2中，2 w的ACh表达显示两种参数正好相反的变化方向；如果考虑到RISGL能够减少此误差的影响，可以发现RISGL参数更能反映真实情况。而且，通过平衡一些干扰因素，可以减少因误差导致的假阳性结果，如结果2.2中，C组与I组各周之间 AISGL与RISGL的变化也出现差异的显著性意义不同的情况，RISGL则可能减少了一些假阳性的显著性差异。许多研究也表明，由于显微镜光源强度的变化、图像分析系统背景光强度分布的不均匀，特别是DAB显色时间的长短、组织切片的厚度、非特异性染色等因素的影响，导致阳性表达物质的灰度或光密度存在较大的不稳定、差异性、误差大等现象[11]。然而，通过与选区内总灰度平均强度的对比，可以尽可能的减少实验过程的系统误差，使结果更具有可靠性和准确性。

从结果2.3中可以发现，ACh表达的总体变化主要是由APPN来反映，存在两种情况：第一APPN与RISGL表现相反的变化方向，但ACh表达的总体变化仍然与APPN的变化方向一致，如图4C-4 w与图4D-4 w、图4C-6 w与图4D-6 w、图4E-4 w与图4F-4 w比较，由于RISGL的变化幅度较小，所以ACh表达的总体变化没有单一受其作用而产生影响，仍然按照APPN的方向变化。但是，变化差异的显著性会随着APPN与RISGL的变化强弱而随之变化，如图4C-4 w与图4D-4 w、图4E-4 w与图4F-4 w的比较发现两者的结合削弱了阳性表达变化的显著性差异，而图4C-6 w与图4D-6 w的比较发现两者的结合仍呈现了阳性表达变化的显著性差异。第二APPN与RISGL变化方向一致，协同作用决定ACh表达的共同变化方向，如图4E-2 w与图4F-2 w、图4E-6 w与图4F-6 w的比较，ACh表达的总体变化还是朝向相同方向。但是，可能由于其中一种参数变化的显著性水平较低，而弱化两参数结合后变化的显著性水平，然而这种弱化可能提示参数代表物质的变化过程或机理。

在本研究中，APPN可以反映待测部位阳性神经元数量和细胞个体大小的综合状况，可根据面积百分比的变化，结合RISGL参数的变化，不仅反映阳性神经元分泌物质的量，而且还可反映阳性神经元分泌神经递质等生物活性物质的分散与聚集情况。如本研究中ACh表达的增加可能是由于反应物染色深度增加(即RISGL升高)，如单个阳性神经分泌的神经递质增多而产生的，也可能是由于阳性面积的增加(即APPN升高)，如神经递质的向外运输传递或新的神经元被激活而产生的，通过APPN与RISGL的结合可以更清晰地发现或推断阳性表达的产生机理。所以本研究采用APPN与RISGL之商，即APPN/RISGL(考虑灰度与阳性表达量呈负相关)来综合反映阳性表达的相对数量，能更直观的反映ACh在下丘脑弓状核的表达。

APPN与TAPN一样能避免免疫组化各步骤未量化和标准化的因素对结果的影响，而且APPN通过考虑选区总面积的因素，能减少可控制的人为的选择性误差。RISGL通过考虑选区内总灰度平均强度的因素，比AISGL能更好地平衡染色背景的影响，减少实验系统误差，并且更好地反映真实情况，减少因误差导致的假阳性结果。通过APPN、RISGL和APPN/RISGL的对比，虽然阳性表达主要由APPN参数反映，有其优势，但还需和阳性神经元的染色灰度信息RISGL结合进行综合评价待检物质的量化变化，使判断更可靠与准确，甚至能提示待检物质的变化过程或机理。随着计算机图像分析技术的发展[12]，如果利用有关的时间分割与空间叠加技术[13]、3D成像技术、虚拟现实或增强现实技术等，把大量的不同层面的高倍图像合成一个三维立体图像，合并计算单层面阳性物质表达量或立体层面阳性物质表达体积量，能为更准确地定量分析免疫组化结果提供可靠解决方法。

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本刊编辑部

Application of area percent of positive neuron and relative intensity of staining grey level in the image quantitative analysis of rat brain tissues immunohistochemistry

ZENG Zhi-gang1△, QIU Hong1, ZHU Mei-ju1, ZHU Hong-zhu1, XIAO Jian-hua2

(1. School of Physical Education, 2. Department of Pediatrics of the Affiliated Hospital, Jinggangshan University, Jiangangshan 343009, China)

Objective: The acetylcholine expression in hypothalamus arcuate nucleus is detected and then the images are processed and analyzed. The features of the image quantitative analysis of immunohistochemistry (IHC) with the method combining two parameters of area percent of positive neuron (APPN) and relative intensity of staining grey level (RISGL) were investigated. Methods: Samples were the immunohistochemical slices of acetylcholine(ACh)expression of hypothalamic arcuate nucleus cholinergic neurons in the process of exercise induced immunosuppression, which included twelve groups of “0 w, 2 w, 4 w, 6 w” and three groups of “control, immediately after exercise, 3 hours after exercise” in every week. IHC technology was used to detect the ACh expression. The image quantitative analysis of IHC was conducted in accordance with the parameters of ACh total area of positive neuron (TAPN), average intensity of staining grey level (AISGL), APPN, RISGL, APPN/RISGL. Then the differences among APPN, RISGL and traditional parameters in the quantitative analysis were compared and the advantages were found. Results: The changes of TAPN and APPN showed almost the same variation. Namely the corresponding significant differences could be found through these two parameters(P<0.05), but the sensitivity and anti-interference of APPN was higher. The results of AISGL and RISGL were not coincident completely. Furthermore, with the combination of APPN and RISGL, the positive expression could be reflected better than any single parameter. Conclusion: The parameters of immunohistochemical image analysis, APPN and RISGL, can be reliable and accurate in image quantitative analysis of IHC. The combination of APPN and RISGL can not only reflect the expression of positive neurons, but also help analyze its mechanism, which is better than traditional analysis parameters.

immunohistochemistry; computer-assisted image processing; small-area analysis; grey level; rat

国家自然科学基金资助项目(31160217，31360255)；江西省教育厅科技项目(GJJ10545)

2017-06-06

2017-02-17

G804；R329

A

1000-6834(2017)03-282-05

10.12047/j.cjap.5460.2017.068

△【通讯作者】Tel: 0796-8100491； E-mail: agang5240@163.com