缺氧肺动脉平滑肌细胞中PKCα/c-fos、Bax/Bcl-2表达变化及其对增殖和凋亡的影响*

曹艳红， 潘建勋， 梁月琴， 师锐赞△

(1. 大同市第五人民医院， 山西 大同 037000； 2. 山西医科大学， 太原 030001)



缺氧肺动脉平滑肌细胞中PKCα/c-fos、Bax/Bcl-2表达变化及其对增殖和凋亡的影响*

曹艳红1， 潘建勋1， 梁月琴2， 师锐赞2△

(1. 大同市第五人民医院， 山西 大同 037000； 2. 山西医科大学， 太原 030001)

目的：研究缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)PKCα/c-fos、Bax/Bcl-2表达的变化及对其增殖和凋亡的影响。方法：将原代培养的大鼠PASMCs分为常氧组(5%CO2、21%O2、74%N2)和低氧组(5%CO2，2% O2，93%N2) 24 h，48 h。通过氮蓝四唑盐(MTT)比色法测定PASMCs的增殖水平，以流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡率，并通过用RT-PCR和Western blot法检测PKCα/c-fos、Bax/Bcl-2基因和蛋白表达的变化。实验至少重复3次，每组设置至少3个复孔。结果：低氧24 h和48 h组PASMCs增殖明显，与常氧组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，而细胞凋亡率无显著变化。相对于常氧组，低氧24 h和48 h组PASMCs PKCα、c-fos表达增强，Bax表达变化不明显，而Bcl-2表达增加。结论：低氧培养的PASMCs增殖明显，凋亡无明显变化。同时PKCα、c-fos表达增强，而抗凋亡基因Bcl-2表达增加。

PKCα/c-fos；Bax/ Bcl-2；增殖；凋亡；低氧

低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是肺心病发病过程中的中心环节，目前研究认为，肺血管结构重建(pulmonary vascular structural remodeling，PVSR)是其最主要的形态学基础，而肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)的增殖和凋亡失衡是PVSR

的重要机制之一。因此，以PASMCs增殖和凋亡为切入点，探讨HPH的发病机制和治疗策略具有重要意义。

据文献报道，PKCα/AP-1通路参与了小牛主动脉的SMCs增殖[1]。另外，抗细胞凋亡基因Bcl-2和凋亡促进基因Bax的比例上调是诱发PASMCs增殖的重要因素[2]。本实验通过原代培养大鼠PASMCs，观察低氧条件下PASMCs增殖和凋亡的变化，同时观察低氧条件下PKCα、c-fos和凋亡相关基因(Bax、Bcl-2)表达的改变。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料

胶原酶Ⅰ型(Sigma公司)，DMEM培养基和胎牛血清(Hyclone公司)，胰酶(Gibco公司)，自动常压缺氧孵箱(德国贺氏公司)，TRIzol、MMLV 逆转录酶、OIigo(dT)15，RNA 酶抑制剂(Invitrogen公司)，兔抗大鼠PKCα、c-fos一抗、辣根过氧化酶(HRP)标记物羊抗兔/鼠IgG(sentacruz Biotechnology公司)、小鼠抗大鼠Bcl-2、Bax一抗(Cell Signaling Technology公司)，MTT细胞增殖、BCA蛋白浓度测定试剂盒 (碧云天公司)，Annexin V/PI凋亡试剂盒(BD公司)。

1.2 大鼠PASMCs培养、纯化与分组

健康雄性Wistar大鼠，体重180～220 g，由山西医科大学实验动物中心[许可证号：医动字第070101]提供。大鼠PASMCs的培养和鉴定采用胶原酶Ⅰ消化法[3]。称量大鼠体重，腹腔注射乌拉坦麻醉后断颈法处死，无菌条件下分离肺动脉，去除血管内膜和外膜，将中膜组织以酶消化法行原代培养，培养于含有20%胎牛血清的DMEM 培养液中，3～4 d更换一次培养液，细胞生长融合铺满瓶壁约80%后，0.25%胰蛋白酶消化传代，接种于新培养瓶扩大培养，首次传代时, 采用差别消化法将PASM Cs与上皮细胞分离。传代培养后改用含有10%胎牛血清的 DMEM 培养液。兔抗大鼠α-SM-actin单克隆抗体免疫荧光鉴定。倒置相差显微镜下观察，PASMCs呈典型的“峰-谷”长势，α-SM-actin染色细胞阳性率98%以上；实验用第 4～8代细胞。将PASMCs随机分成以下组：常氧组(normoxia group, N)、低氧组(hypoxia group, H)。低氧培养采用37℃、2%O2、93% N2和5% CO2，时间点设为24 h，48 h。常氧对照组条件为37℃、21% O2、74% N2和5% CO2。

1.3 MTT法测定PASMCs增殖

以2×103cells/well接种PASMCs于96孔板，各组设6个平行复孔，在边缘区域设立对照 (只加培养液，不加细胞 )，在37℃、5%CO2条件下培养24 h。生长成层后换无血清 DMEM 培养基同步化24 h。将培养板移入不同条件培养环境中继续培养，培养板中每孔终体积200 μl。特定时间点检测时，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml) 20 μl，37℃继续孵育4 h，每孔加入150 μl DMSO，将培养板平放在平板振荡器上摇振10 min，使结晶物完全溶解。在酶标仪上选择490 nm波长测定各孔吸光度值[D(490)]。

1.4 Annexin V-FITC/PI染色法检测PASMCs凋亡率

参照Annexin V /PI双染凋亡试剂盒操作说明书操作。0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，用100 μlBinding buffer将待测细胞的密度调整为5×105～1×106个细胞悬液，加入5 μl Annexin V-FITC标记液和5 μl PI，轻轻混匀。避光室温染色15 min，400 μl Binding buffer重悬细胞，流式细胞仪(FACS calibur，BD)测定各组细胞发生凋亡的百分数。

1.5 RT-PCR法检测基因表达

Trizol提取各组单克隆细胞总RNA，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得的总RNA用20 μl DEPC水溶解。紫外吸收法测定总RNA在吸光度260 nm和280 nm处吸收值，计算其浓度和纯度。取总RNA 2 μg，按Invitrogen公司MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA，进行PCR反应。引物序列、退火温度及产物bp数见表1。以β-actin mRNA表达水平作为内部标定基因对照。PCR产物在1.5%～1.8%的琼脂糖凝胶上电泳，条带经紫外显色灰度扫描。实验重复3次。

Tab. 1 Primer sequences of PKCα, c-fos, Bax, Bcl-2 and β-actin

Tar-getgenePrimersequence(5'➝3')Productsize(bp)Tm(℃)PKCαP1:CCAAACGGGCTTTCAGAT42360P2:TTCACTCGGT-CAAGGTTGTTc-fosP1:GTCTCCAGTGC-CAACTTCAT28954P2:CAGCCATCTTATTC-CTTTCCBcl-2P1:CTGGTGGACAA-CATCGCTCTG22854P2:GGTCTGCTGACCT-CACTTGTGBaxP1:GCGAATTGGAGAT-GAACTGG36655P2:GTGAGCGAGGCGGT-GAGGACβ-ac-tinP1:CTACAATGAGCT-GCGTGTGGC27055P2:CAGGTCCAGACG-CAGGATGGC

1.6 Western blot检测蛋白表达

提取细胞总蛋白，通聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素滤膜(NC膜)上，脱脂奶粉封闭后，一抗4℃杂交过夜，并与HRP标记的二抗杂交，置摇床室温孵育1 h。洗膜后暗室加入ECL溶液，进一步显影、定影。以β-actin蛋白表达水平作为内部标定蛋白对照，以消除蛋白上样量不同带来的误差。实验重复3次。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 低氧PASMCs增殖的改变

MTT结果表明，PASMCs细胞经常氧、低氧处理24 h和48 h后，低氧组在490 nm处吸光度值均高于常氧组(图1)。24 h和48 h常氧组和低氧组在490 nm处吸光度值分别为0.74±0.01和0.81±0.02、0.77±0.01和0.84±0.01。结果表明：低氧明显促进PASMCs的增殖 (P<0.01)，且低氧处理48 h后PASMCs的增殖明显高于24 h (P<0.01)。

Fig. 1 The proliferation of rat PASMCs in hypoxia**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vshypoxic group 24 h

2.2 低氧对PASMCs凋亡的影响

FITC-Annexin V/PI染色检测结果显示，常氧组PASMCs的凋亡率为6.68%±0.97%, 低氧24 h和48 h培养的PASMCs的凋亡细胞数和常氧组凋亡率分别为7.54%±0.72%和6.58%±1.13 %，各组凋亡率均在10%以内(图2)，各组之间的凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，提示低氧条件下PASMCs的凋亡率相比常氧无明显增加。

Fig. 2 Apoptosis of rat PASMCs in hypoxia A: Normal group; B: Hypoxic group 24 h; C: Hypoxic group 48 h

2.3 低氧PASMCs PKCα、c-fos表达的改变

PASMCs细胞经低氧处理特定的时间后，PKCα、c-fos mRNA(图3A)和蛋白表达(图3B)在24 h即有升高，48 h达高峰。如图3C和图3D所示，与β示actin比较，PKCα mRNA在常氧组、低氧24 h 和48 h的灰度值分别为: 0.19±0.01，0.54±0.04，0.71±0.03; c-fos mRNA在各组的灰度值分别为：0.20±0.01, 0.71±0.04, 0.93±0.07；PKCα蛋白在各组的灰度值分别为: 0.61±0.04，1.75±0.07，2.37±0.04; C-FOS蛋白在各组的灰度值分别为：0.69±0.02, 1.72±0.03, 2.54±0.15。这些结果证实PASMCs PKCα、c-fos在低氧条件下的表达呈时间依赖增强。

Fig. 3 Effects of hypoxia on the expressions of PKCα and c-fosin PASMCs A, B: The mRNA and protein expression of PKCα and c-fos in different groups; C, D: Relative mRNA and protein expression of PKCα, c-fos to β-actin; N: Normoxia group; H: Hypoxia group; H24: Hypoxia group 24 h; H48: Hypoxia for 48 h**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vshypoxic group 24 h

2.4 低氧PASMCs Bax、Bcl-2表达的改变

PASMCs细胞经低氧处理24 h和48 h后，Bax mRNA和蛋白表达未出现明显变化，而Bcl-2 mRNA(图4A)和蛋白表达增强(图4B)。如图4C和图4D所示，与β-actin比较，bax mRNA在常氧组、低氧24 h 和48 h的灰度值分别为: 0.16±0.008，0.15±0.001，0.15±0.003; Bcl-2 mRNA在各组的灰度值分别为：0.15±0.01, 0.48±0.03, 0.85±0.07；Bax蛋白在各组的灰度值分别为: 0.53±0.05，0.55±0.06，0.52±0.04; Bcl-2蛋白在各组的灰度值分别为：1.73±0.07, 2.56±0.28, 3.65±0.23。这些结果证实Bcl-2在低氧条件下的表达呈时间依赖增强。

Fig. 4 Effects of hypoxia on the expressions of Bax and Bcl-2 in PASMCs A, B: The mRNA and protein expression of Bax, Bcl-2 in different groups; C, D: Relative mRNA and protein expression of Bax, Bcl-2 to β-actin; N: Normoxia group; H: Hypoxia group; H24: Hypoxia group 24 h; H48: Hypoxia for 48 h*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vshypoxic group 24 h

3 讨论

近年来，随着分子生物学和基因组学的发展，针对PASMCs增殖和凋亡失衡的分子靶向治疗已成为HPH生物治疗的最新发展方向[4]。尽管近十年来HPH的药物治疗取得了较大进展，但目前尚缺乏特异性治疗措施。因此，研究PASMCs增殖和凋亡失衡的分子基础，是探讨HPH、慢性肺源性心脏病及其他血管疾病发生机制的一个重要方向。本研究以低氧条件下PASMCs作为细胞模型，观察低氧对PKCα、AP-1、Bcl-2、Bax基因表达的影响，为探讨HPH的发病机制和治疗策略奠定实验基础。

多个因子及信号通路参与HPH中PASMCs增殖和凋亡失衡。PKC属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族，PKC亚型的表达和活性异常在调节细胞的增殖、生长、分化、凋亡、运动、肿瘤的形成和转移等过程均起着重要作用[5,6]，研究证实活化的PKC促进血管平滑肌的增生，在HPH发生发展中起重要作用。本课题结果表明，低氧培养24 h和48 h PASMCs的PKCα基因和蛋白表达呈时间依赖性增强，提示PKCα的激活促进低氧条件下PASMCs增殖。有关PKCα促PASMCs的分子机制，有研究表明，香烟烟雾提取物促进PASMCs增殖，其机制与PKCα激活并促进cyclin D1表达有关[7]，另有研究表明，PKC活化后可刺激原癌基因c-fos、sis等表达，而后者被激活后结合至cyclin D1启动子区，诱导cyclin D1等的转录，发挥其促增殖作用[8]。因此本课题进一步检测低氧条件下的c-fos表达变化。结果表明，低氧培养PASMCs 24 h和48 h后c-fos基因和蛋白表达呈时间依赖性地增强。以上结果提示低氧条件下的PASMCs PKCα/c-fos表达异常，但对于cyclin D1是否是其下游靶点仍需进一步的实验验证。

PASMCs异常增殖同时是否伴有凋亡水平的改变，尚有很多争论。Yu等的实验研究发现，低氧刺激大鼠PASMCs增殖，同时抑制细胞凋亡，导致肺血管重塑[9]。Luo等报道，低氧过程中，HIF-1α通过增强glycolysis活性，降低培养液的pH值，促进A549细胞凋亡增加[10]。本研究结果表明，低氧24 h和48 h对PASMCs的凋亡率影响不明显。进一步对凋亡相关基因的检测结果表明，相对于常氧组，低氧培养PASMCs24 h和48 h后Bax表达变化不明显，而抗凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白表达呈时间依赖性增多。Bcl-2和Bax的比例上调是诱发PASMCs增殖的重要因素。综合以上结果表明，低氧条件下PASMCs的增殖和凋亡失衡，而PKCα/c-fos及Bcl-2表达的改变可能是其原因之一。

结合本研究的实验结果可以发现，低氧条件下增殖凋亡相关基因的改变可能是造成PASMCs增殖和凋亡的失衡、PVSR的主要原因。因此，以特定的增殖凋亡相关基因为靶点，抑制PASMCs的异常增殖，诱导其凋亡，无疑是改善PVSR、治疗HPH的有效方法。

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Effects of PKCα/c-fos, Bax/Bcl-2 expression on the proliferation and apoptosis of rat pulmonary arterial smooth muscle cells in hypoxia

CAO Yan-hong1, PAN Jian-xun1, LIANG Yue-qin2, SHI Rui-zan2△

(1. Datong the Fifth People's Hospital, Datong 037000; 2. Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

Objective: To explore the effects of PKCα/c-fos, Bax/Bcl-2 on the proliferation and apoptosis of rat pulmonary arterial smooth musclecells(PASMCs) in hypoxia． Methods: The PASMCs of rats had been isolated and cultured, and then were cultured under normoxia(5%CO2、21%O2、74%N2)and hypoxia(5%CO2，2% O2，93%N2)condition for 24 h and 48 h, respectively．The proliferation of PASMCs was tested by methylthiazolyltetrazolium (MTT)． The changes of PASMCs apoptosis were detected by Annexin V-FITC/PI staining combined flow cytometry. RT-PCR and Western blot analysis were performed to detect the gene and protein levels of PKCα/c-fos, Bax/Bcl-2, respectively. All experiments were repeated three times with at least triplicate samples. Results: The proliferation of PASMCs in hypoxia group were stronger than that of normoxia group after 24 h and 48 h (P<0.01), while the apoptosis rate did not change significantly．Meanwhile, the higher levels of PKCα, c-fos, Bcl-2 mRNA and proteins after hypoxia for 24 h and 48 h were detected by RT-PCR and Western blot analysis, while the expression levels of Bax had no significant difference under normoxic and hypoxic conditions. Conclusion: Elevated proliferation and expression of PKCα, c-fos, Bcl-2 was observed in rat PASMCs in hypoxia, and while the apoptosis rate had no significant change.

PKCα/c-fos; Bax/Bcl-2; proliferation; apoptosis; hypoxia

山西省青年科技研究基金资助项目(2014021038-3)；山西医科大学校科技创新基金资助项目(01201308)；山西医科大学博士启动基金资助项目(B032001207)

2016-03-28

2016-12-07

R563. 9

A

1000-6834(2017)03-218-05

10.12047/j.cjap.5442.2017.054

△【通讯作者】Tel: 0351-4135079; E-mail: shiruizan@163.com