黄瓜品种田间性状比对与部分品种SSR指纹图谱的构建分析

贺长征+刘峰+周莹

摘 要： 对搜集到的150个品种进行田间品种对比试验，于2016年筛查出30个高产优质黄瓜新品种进入下一轮田间种植试验，同时通过田间性状比对发现部分品种类型相似。依照《NY/T2474—2013 黄瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法》标准，构建了44个品种的指纹图谱，并以指纹数据为基础利用NTsys分析软件构建了品种聚类图，依据标准中的判定标准发现4组（共计10个品种）疑为同品种，7组（共计20个品种）为近似品种，最后对田间性状相似品种和SSR鉴定相似品种进行了比较分析。

关键词： 黄瓜；SSR；品种真实性；指纹数据；聚类分析

中图分类号：S642.2 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.06.003

Abstract： The field varieties of 150 varieties were compared and tested. In 2016， 30 new varieties of high yield and good quality cucumber were screened and entered the next round of field planting experiment. At the same time， it was found that some varieties were similar by field character comparison. The fingerprints of 44 cultivars were constructed according to “NY/T2474-2013 the technical standard of cucumber variety identification and SSR molecular marker”. Based on the fingerprint data， the dendrogram was constructed by using NTsys analysis software. 4 groups （10 varieties） were suspected to be of the same breed， and the 7 groups （20 varieties） were approximate varieties. Finally， a comparative analysis was made on similar varieties and similar varieties of SSR identification.

Key words： cucumber； SSR； varieties authenticity； fingerprinting data； cluster analysis

黃瓜（Cucumis Sativus L.）属于葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜属（Cucumis），一年生蔓性或攀援草本植物，在我国已有1500多年的栽培历史[1]。作为世界十大蔬菜之一，黄瓜在全球的栽培面积仅次于番茄[2]，我国的黄瓜生产总面积与总产量在世界位居榜首，且黄瓜还是我国保护地栽培作物中第一大蔬菜作物[3]。黄瓜肉质脆嫩、汁多味甘，早已实现周年供应，其育种研究多次列入国家级项目[4]，我国在黄瓜育种工作中不断获得重大进展。黄瓜产业是天津市的技术优势产业，种植面积达每年1.2×104 hm2，每年产量76×104 t。随着黄瓜产业的快速发展以及国家政策的不断放开，大量种子公司不断涌现，造成了目前黄瓜种业市场秩序混乱，小、散、乱现象特别突出，严重危害了品种所有企业的利益，导致国内黄瓜主导企业优势地位和市场占有率下降，影响了黄瓜种业的有序发展，给生产造成极大损失。

国际植物品种权保护组织（UPOV， 2005）在BMT测试指南草案中，将构建DNA指纹数据库的标记方法确定为SSR和SNP，其中SSR具有按照孟德尔遗传方式分离、共显性遗传、位点数量多、多态性高、试验程序简单等优点[5]，在农作物品种鉴定的研究上得到了广泛的应用。在黄瓜品种真实性的鉴定方法中，田间种植鉴定方法直观、可靠，但是费时、费工、成本高，需要2～3个月才能出结果，周期长、工作量大、且易受环境因素的影响[3]。2009年，黄瓜全基因测序的完成[6]，分子标记技术的快速发展，使得利用分子标记技术进行品种的真实性鉴定成为可能。2014年4月，《NY/T 2474—2013 黄瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法》实施，为我国规范黄瓜种业提供了标准支撑。本研究旨在对搜集到的150个品种进行田间品种对比试验，并随机选择44个品种进行指纹图谱构建、真实性鉴定和遗传距离分析等实验室研究工作。

1 材料和方法

1.1 材 料

以天津市优势产业单位天津科润黄瓜研究所、天津德瑞特种业有限公司研发的新品种为主要对象，同时搜集北京、广东、山东、上海等地市场上各种类型的黄瓜栽培品种，共收集到黄瓜新品种150个。对收集的样品分类整理、编号，进行品种真实性鉴定标准的技术开发与应用研究，同步安排田间比对试验。

35对SSR引物序列来自于NY/T 2474—2013，编号依次为CU01-CU35，全部由ABI公司合成。PCR反应中的dNTP和Taq酶购自北京柏树美生物技术有限公司（Genacea）。

1.2 方 法

1.2.1 田间试验 对项目收集的150个黄瓜品种样品安排田间对比试验。试验地点为天津市科润黄瓜研究所，2016年3月28日大棚直播，每品种播一行，对照品种为津优35。田间调查记载性状为节位、瓜长、把长、色泽、抗病性、产量等。

1.2.2 DNA提取 黄瓜干种子DNA提取方法：随机数取30粒种子，加入适量石英砂，德国Restech研磨仪，频率29 frequency·s-1，时间30 s至粉末状，取样100 mg左右至离心管，利用天根植物DNA提取试剂盒，按照步骤提取，所提DNA经K5500超微量分光光度计测量DNA的浓度和纯度，-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增 PCR扩增采用384孔板12 μL体系进行（表1）。PCR反应程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min；16 ℃保存。

1.2.4 等位基因检测 将35对黄瓜SSR引物根据等位基因变异范围和颜色将其分成8组（表2），同一组内引物PCR产物混合，将每一对PCR产物稀释13倍。从混合液中吸取1 μL加入到DNA分析仪（ABI 3500XL）深孔板中。板中各孔加入0.1 μL LIZ500分子量内标和8.9 μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95 ℃变性5 min，4 ℃保存。瞬间离心10 s后上机电泳。

1.3 数据记录和统计分析

（1）数据记录。使用DNA分析仪3500XL的片段分析软件Genemapper，编写Panel，读出每个位点每个样品的等位基因扩增片段大小数据。

（2）数据统计分析。利用NTSYS-pc 软件（Version 2.10e）计算Dice遗传相似性系数GS=2a/（2a+b+c）。其中：a为任意两品种共享谱带数；b和c为相应两品种间的差异条带。用UPGMA（Unweighted pair grouping method with arithmetic mean）法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 田间调查结果

2016年5月12日至6月29日共摘瓜21次。根据试验结果，筛查出30个高产优质黄瓜新品种进入下一轮田间种植试验（表3），同时通过田间性状比对发现部分品种类型相似（表4）。

2.2 44份黄瓜品种指纹数据

使用DNA片段大小分析软件，读出每个位点每个样品的等位基因扩增片段大小数据，利用SSR数据处理宏程序DataTrans1.0[7]将片段大小数据转化为1和0，构建品种的指纹数据（表5）。

2.3 44份品种聚类分析

利用NTSYS-pc 软件（Version 2.10e）计算Dice遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析。44个品种在遗传相似系数为0.81的时候聚为一类（图1），品种整体上遗传基础狭窄。品种间的遗传距离较近也反映了黄瓜育种种质间遗传距离狭窄，黄瓜育种若在遗传基础狭窄的种质基础上增大品种间的特异性困难就很大。提高黄瓜育种种质本身的遗传多样性，加大不同地区的黄瓜种质材料的交换使用，加强不同育种单位之间育种工作的合作，是提高黄瓜品种特异性的一条重要途径。

在遗传相似系数为1时，10个品种分为4组：①②③④。津绿30-8和博杰616为①组，指纹数据完全相同，疑为同品种，依次类推其他3组。在遗传相似系数大于0.98时，20个品种分为7组：I～VII，指纹数据仅有1个位点差别，为近似品种（图2）。

2.4 田间性状相似品种和SSR鉴定相似品种比较分析

在随机选择的44份用于SSR指纹分析的品种中，有17个品种为田间性状相似品种。17个品种分别为德瑞特8-9B，博耐E02，金胚98，津绿21-10，盛丰908，蔬春宝秀，腾达黄瓜，乾德二号，佳育908，中研二十一优，中华518，大澳001，盛美186，瑞新金宝，中研十九，妙收冠军，佳育18。

17个田间性状相似品种中，SSR指纹数据分析结果为近似品种的有11个，分别为德瑞特8-9B，博耐E02，金胚98，津绿21-10，盛丰908，蔬春宝秀，乾德二号，中研二十一优，中华518，瑞新金宝，妙收冠军。

SSR指纹数据分析结果为近似品种中的9个品种，在2016年田间性状比较中未被记录为相似品种，分别为津绿30-8，博杰616，博杰100，津優301号，津优35号，津绿1900，盛美190，博杰105和华夏617。

在2017年的田间性状观察中，应重点记录上述9个品种的田间数据，进一步加强SSR在品种真实性鉴定中的作用。

3 结 论

本研究对搜集到的150个品种进行田间品种对比试验，于2016年筛查出30个高产优质黄瓜新品种进入下一轮田间种植试验，同时通过田间性状比对发现有24个品种类型相似。利用SSR技术构建了44个品种的指纹图谱，应用NTsys分析软件构建了品种聚类图，发现20个品种为相似品种。分析表明，17个田间性状相似品种中，使用SSR指纹数据分析结果发现为近似品种的有11个。SSR指纹数据分析结果为近似品种的9个品种，在2016年田间性状比较中未被记录为相似品种，在2017年的田间观察中应详细记录并分析研究。

参考文献：

[1]周长久.蔬菜种质资源概论[M].北京：北京农业大学出版社，1995：163.

[2]李怀智.我国黄瓜的栽培现状及其发展趋势[J].蔬菜，2003（8）：3-4.

[3]程周超.黄瓜SSR遗传图谱的构建及黄瓜重要农艺性状的QTL定位[D].北京：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，2010.

[4]顾兴芳，张圣平，王烨.我国黄瓜育种研究进展[J].中国蔬菜，2005（12）：1-7.

[5]EUJAY L，SLEDGE M K ，WANG L. Medicago truncatula EST-SSRs reveal cross-species genetic markers for medicago spp[J].Theor appl genet，2004，108（3）：414-422.

[6]REN Y， ZHANG Z H， LIU J H. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome[J].Plos one，2009，4（6）：e5795.

[7]盖红梅，任民. SSR 数据处理宏程序 DataTrans 1.0[J].分子植物育种，2011（9）：48.