贝那普利对肝纤维化大鼠Ang-(1-7)、ACE2及Mas受体mRNA的影响

丁少华，申凤俊，王丽华

（山西医科大学第一医院消化内科，山西 太原 030001）

贝那普利对肝纤维化大鼠Ang-(1-7)、ACE2及Mas受体mRNA的影响

丁少华，申凤俊，王丽华

（山西医科大学第一医院消化内科，山西 太原 030001）

目的 观察血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)贝那普利抗大鼠肝纤维化的疗效，研究贝那普利对肝纤维化大鼠肝组织血管紧张素-（1-7）[Ang-(1-7)]、血管紧张素转换酶2（ACE2）mRNA及Mas受体mRNA的影响。方法制备四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化模型，同时应用贝那普利灌胃，共8w。对肝组织进行常规HE及Masson染色，ELISA测定肝匀浆血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、Ang-(1-7)浓度，计算AngⅡ/Ang-(1-7)比值，实时荧光定量PCR测定肝组织ACE2mRNA和Mas受体mRNA的水平。结果造模6、8周末，贝那普利治疗组大鼠的肝纤维化程度均较模型组减轻；肝匀浆AngⅡ的浓度较模型组降低（P＜0.05)，肝匀浆Ang-(1-7)的浓度较模型组增加（P＜0.05)，肝匀浆AngⅡ/Ang-(1-7)的比值较模型组降低（P＜0.05)；贝那普利治疗组肝组织ACE2及Mas受体mRNA的水平均较模型组增加（P＜0.05)。结论贝那普利具有良好的抗肝纤维化作用，其机制可能与AngⅡ浓度降低，Ang-(1-7)浓度增加，AngⅡ/Ang-(1-7)比值降低有关，亦可能与ACE2和Mas受体表达增加有关。

肝纤维化；贝那普利；AngⅡ；Ang-(1-7)；ACE2；Mas受体

肾素血管紧张素系统（renin angiotensin system，RAS）是人体内重要的体液调节系统。心脏、肾脏局部RAS的激活，是导致组织损伤后心、肾间质纤维化发生的主要因素，抑制RAS活性可显著抑制心、肾间质纤维化的发生[1-2]。研究表明，肝脏局部存在的RAS亦与肝纤维化密切相关。传统的血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）-AngⅡ-血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensinⅡ receptor type1 AT1R）轴通过AngⅡ与其相应受体AT1R结合，促进肝星状细胞的激活和细胞外基质的合成。ACE2-Ang-(1-7)-Mas为RAS系统新发现的作用轴，Ang-(1-7)与其特异性的Mas受体结合，发挥拮抗AngⅡ/AT1R的生物学作用，进而保护肝纤维化[3]。贝那普利为血管紧张素转换酶抑制药，该药特点为出现作用慢，但维持作用时间长。既往大鼠肝纤维化模型实验证实贝那普利有良好的抗肝纤维化作用，本研究欲进一步观察贝那普利对肝纤维化大鼠肝组织Ang-(1-7)浓度的影响，以及从分子生物学水平研究贝那普利对肝纤维化大鼠肝组织ACE2和Mas受体表达的影响。进一步探究贝那普利抗肝纤维化的作用机制，期望为临床肝纤维化以及肝硬化的治疗提供新思路和途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SD雄性大鼠，体质量(200±10)g，购自河北医科大学实验动物中心；CCL4购自天津傲然精细化工研究所；盐酸贝那普利片购自成都地奥制药集团有限公司；Masson三色染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；大鼠Ang-(1-7)、AngⅡELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；冻存液购自北京莱索宝科技有限公司；TRIzol裂解液、氯仿、异丙醇、0.25%胰蛋白酶、随机引物、dNTP、ROX（FastStart Universal SYBR Green Master）、引物、Buffer、RNA酶抑制剂、逆转录酶均购自上海生工生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备：将购回的清洁级健康雄性SD大鼠在生理实验室正常饮食1周，以适应环境。7 d后将大鼠随机分为正常对照组（12只），模型组（14只），贝那普利治疗组（14只）。除正常对照组外，其余两组大鼠均皮下注射40% CCL4油剂，2次/w，首次注射剂量为5 mL/kg，之后为2 mL/kg，正常对照组始终给予相同剂量油剂皮下注射。与此同时，贝那普利治疗组于造模第1天起每天给予10 mg/kg的贝那普利灌胃，其余两组给予相同剂量生理盐水灌胃，至实验结束。于实验6、8周末处死3组大鼠各6只，留取肝组织备用。模型组与贝那普利组大鼠造模过程中各死亡2只大鼠。

1.2.2 获取标本：大鼠处死前禁食12小时，用25%乌拉坦（4 ml/1kg)腹腔注射麻醉妥后，无菌操作打开腹腔，观察肝脏大小、色泽、质地，有无结节。取肝左叶组织适量用10%甲醛溶液固定，取2块适宜大小的肝左叶组织于冻存管中，保存于-80℃冰箱。

1.2.3 肝组织病理染色：将包埋好的肝组织蜡块以2～3μm厚度切片，常规HE染色，按照Masson染色试剂盒说明书进行Masson染色。封片后置于光学显微镜下观察。

1.2.4 酶联免疫吸附法（ELISA)测定肝匀浆AngⅡ、Ang-(1-7)含量：按照AngⅡ、Ang-(1-7)ELISA试剂盒说明书测出吸光值，应用计算机软件根据标本吸光值计算出相应的AngⅡ、Ang-(1-7)含量。

1.2.5 Real-time PCR测定肝组织ACE2 mRNA、Mas受体mRNA的水平：用Trizol法抽提取肝组织总RNA。应用分光光度计测定，计算出总RNA的浓度及纯度，纯度在0.18～0.21则表示总RNA的纯度较好。继而根据Fermentas K 1622反应体系进行逆转录，-20℃保存备用。采用FastStart Universal SYBRGreen Master(ROX)反应体系进行定量测定。内参Beta-actin上游：5'-gtcaggtcatc actatcggcaat-3'，下游：5'-agaggtctttacggatgtcaacgt-3'，产物长度为147bp。ACE2上游：5’-gctaaacatgatggcccact-3’，下游：5’-cccacagtcgaattcctgtt-3’，长度为218bp。Mas受体上游：5’-ctctcggctttgtggagaac-3’,下游：5’-ggcctgtgttgtagccaaat-3’,长度为228bp。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件分析处理实验数据，计量资料采用“±s”表示，符合正态性检验、方差齐性检验行单因素方差分析，不符合上述条件者行 Kruskal-Wallis秩和检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状况比较 正常对照组大鼠精神、活动、饮食良好，毛色光泽正常，体质量随实验时间延长逐渐增加。模型组大鼠从造模第3周开始出现饮食、活动量减少，毛色黯淡,体质量增长较对照组缓慢。贝那普利组大鼠活动、食欲、毛色光泽较模型组好。造模6周末模型组大鼠开始出现体质量下降。

2.2 组织病理学变化 HE和Masson三色染色后，采用改良Knodell评分标准评估肝纤维化程度；（1）正常对照组肝小叶结构正常，肝细胞索排列整齐，肝细胞无病变。（2）造模6 w：模型组和贝那普利组肝细胞变性、坏死、脂变严重，模型组肝内有明显纤维间隔形成。（3）造模8 w：贝那普利组肝细胞变性、坏死、脂变进一步加重，肝内出现少量的纤维间隔；模型组已形成稳定的完全性中心-中心和(或)中心-门静脉性纤维间隔并存的肝纤维化。

2.3 大鼠肝匀浆AngⅡ、Ang-(1-7)浓度及AngⅡ/Ang-(1-7)比值 （1）6、8周末，模型组大鼠肝匀浆AngⅡ浓度较正常对照组明显增高（P＜0.01),贝那普利组较模型组降低（P＜0.05)。见表1。 6周、8周末，模型组肝匀浆Ang-（1-7）浓度较正常对照组明显增高（P＜0.01),贝那普利组较模型组进一步增高（P＜0.05)。见表1。

表1 肝匀浆AngⅡ、Ang-(1-7)浓度变化（±s，ng/mL)Table 1 Changes of Ang Ⅱ and Ang-(1-7)in Liver Homogenate(±s,ng/mL)

表1 肝匀浆AngⅡ、Ang-(1-7)浓度变化（±s，ng/mL)Table 1 Changes of Ang Ⅱ and Ang-(1-7)in Liver Homogenate(±s,ng/mL)

注:与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05

F值80.200 99.034 255.682 221.526时间6周8周指标AngⅡAng-(1-7) AngⅡAng-(1-7)对照组（n=6）23.330±1.606 40.008±2.268 23.261±1.482 40.097±1.497模型组（n=6）42.649±4.337a53.720±2.660a48.626±1.357a59.660±2.774a贝那普利组（n=6）39.163±1.547b57.260±1.695b45.518±3.072b62.358±1.295b

（2）6、8周末，模型组大鼠肝匀浆AngⅡ/Ang-(1-7)比值较正常对照组增高（P＜0.01),贝那普利预防治疗组较模型组降低（P＜0.05)。见表2。

表2 肝匀浆AngⅡ/Ang-(1-7)比值变化（±s）Table 2 Changes ofAngⅡ/Ang-(1-7)Ratio in Liver Homogenate (±s)

表2 肝匀浆AngⅡ/Ang-(1-7)比值变化（±s）Table 2 Changes ofAngⅡ/Ang-(1-7)Ratio in Liver Homogenate (±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

F值21.703 48.292时间6周8周对照组（n=6）0.585±0.043 0.581±0.042模型组（n=6）0.794±0.073a0.816±0.043a贝那普利组（n=6）0.684±0.044b0.732±0.041b

2.4 大鼠肝组织ACE2 mRNA、Mas受体mRNA的水平 6、8周末模型组大鼠肝组织ACE2 mRNA、Mas受体mRNA水平较对照组增加（P＜0.05）；那普利组大鼠肝组织ACE2mRNA、Mas受体mRNA含量较模型组进一步增加（P＜0.05)。见表3、表4。

表3 大鼠肝组织ACE2 mRNA水平（±s）Table 3 The level ofACE2 mRNAin rat liver(±s)

表3 大鼠肝组织ACE2 mRNA水平（±s）Table 3 The level ofACE2 mRNAin rat liver(±s)

注:与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

F值61.186 281.101时间6周8周对照组（n=6）1.189±0.184 1.232±0.148模型组（n=6）2.284±0.322a2.813±0.290a贝那普利组（n=6）3.400±0.471b4.015±0.146b

3 讨论

病毒、酒精、药物、毒物、自身免疫等因素导致的肝脏炎症或损伤，在其修复过程中，可代偿性引起肝纤维化。肝纤维化是慢性肝病进展为肝硬化的关键阶段。作为RAS为人体内重要的体液调节系统，近年研究显示,肝脏内局部RAS系统与肝纤维化形成密切相关[4-5]。经典的ACE-AngⅡ-AT1R轴促进HF的发生发展，AngⅡ是该轴核心效应分子，研究者提出肝脏局部的AngⅡ持续增高，对肝纤维化起更重要的调节作用。目前已经通过研究证实ACEI和ARB药物有良好的抗肝纤维化作用[5-7]。近期氯沙坦已被进一步用到改善肝纤维化的临床试验观察，且研究显示缬沙坦可使肝硬化患者肝纤维化指标下降，肝功能改善[8-9]。ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴为RAS系统新发现的作用轴，在体内外可拮抗AngⅡ的活性,发挥舒张血管、降低血压、利尿、抑制成纤维细胞增殖等作用。

表4 大鼠肝组织Mas受体 mRNA水平（±s)Table 4 Expression of Mas Receptor mRNAin Rat Liver Tissue (±s)

表4 大鼠肝组织Mas受体 mRNA水平（±s)Table 4 Expression of Mas Receptor mRNAin Rat Liver Tissue (±s)

注:与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

F值124.685 129.572时间6周8周对照组（n=6）0.378±0.071 0.378±0.072模型组（n=6）3.734±0.483a6.000±1.103a贝那普利组（n=6）8.132±1.394b11.984±1.860b

本研究结果显示，大鼠肝纤维化模型组AngⅡ、Ang-(1-7)浓度及Mas受体mRNA含量均较正常对照组增加，证实了肝纤维化形成过程中AngⅡ/ATIR及Ang-(1-7)/Mas均被激活。李旭等[10]通过给胆管结扎大鼠持续腹腔注射Ang-（1-7），得出Ang-(1-7)治疗组肝纤维化评分、胶原面积、肝星状细胞α-SMA的表达较胆管结扎组显著减少。另有研究者发现Mas受体拮抗剂A779可阻断胆管结扎肝纤维化大鼠Ang-(1-7)的作用使转化生长因子β（TGF-β1）水平增高，加重肝纤维化；而Mas受体特异性激动剂则可以降低TGF-β1蛋白及其mRNA的表达，减轻肝纤维化程度。本研究结果显示，贝那普利治疗组肝组织AngⅡ浓度较模型组降低，Ang-(1-7)浓度及Mas受体mRNA含量较模型组增加，提示贝那普利不仅抑制肝组织AngⅡ的生成，而且可能通过增加Ang-(1-7)浓度以及Mas受体的表达，从而发挥抗肝纤维化效应。

Vilas-Boas等[11]研究发现Ang-(1-7)/AngⅡ在轻-中度肝病患者中会增高，考虑Ang-(1-7)与AngⅡ之间的平衡在肝纤维化发病机制中扮演重要角色。申凤俊等通过临床试验[12]研究正常人、慢性乙肝患者、肝硬化患者的AngⅡ/Ang-(1-7)比值变化，结果显示肝硬化组AngⅡ/Ang-(1-7)比值较慢性乙肝组增高，得出AngⅡ/Ang(1-7)比值越高，肝纤维化程度越重，患者病情亦越重。本实验结果：模型组大鼠AngⅡ/Ang(1-7)比值较对照组增高，与以往研究一致。贝那普利预防治疗组大鼠6、8 w末AngⅡ/Ang-(1-7)比值均较模型组降低，且肝纤维化程度较模型组亦减轻。由于Ang-(1-7)在ACE催化作用下会转化为无活性的Ang-（1-5），贝那普利可抑制ACE作用，进而抑制Ang-(1-7)的降解，表现为增加Ang-(1-7)的浓度。因此我们考虑贝那普利可能通过抑制AngⅡ的生成，且增加Ang-(1-7)的浓度，表现为降低AngⅡ/ Ang-(1-7)比值,从而阻止肝纤维化的进展。

正常肝脏中，ACE2表达很少，慢性肝损伤导致肝纤维化时，ACE2在基因和蛋白水平均表达增加。本研究结果显示，模型组ACE2 mRNA含量较正常对照组增加，与以上研究结论相似。ACE2被认为是慢性肝损伤的负性调节剂，具有抗肝纤维化作用。Osterreicher等[13]在实验中将小鼠的ACE2基因敲除，发现敲除ACE2基因的小鼠比野生小鼠表现出更严重的肝纤维化。应用ACE2重组体进行治疗，可明显减轻慢性肝损伤导致的肝纤维化。Huang等[14]研究认为ACEI可使肝组织ACE2表达增加，但也有研究者认为ACEI对ACE2表达无明显影响。本研究结果显示，贝那普利组肝组织ACE2 mRNA含量较肝纤维化模型组增高，这与Huang等[14]的研究一致。

综上所述，本研究认为在病因刺激下肝脏局部ACE-AngⅡ-AT1R轴和ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴均被激活，在一定时间段内两轴调节作用维持动态平衡，随着有害因素持续存在或加重，最终在ACE-AngⅡ-AT1R轴作用下促使肝纤维化甚至肝硬化的发生。血管紧张素转换酶抑制剂贝那普利可能通过抑制AngⅡ的生成，增加Ang-(1-7)的浓度，使AngⅡ/Ang-(1-7)比值降低，发挥抗肝纤维化的作用。亦可能通过使ACE2、Mas受体表达增加，从而延缓肝纤维化的进程。本研究有望对临床寻求肝纤维化新的治疗方法提供进一步的实验依据。

[1]Varo N,Iraburu MJ,Varela M,et al.Chronic AT1 blockade stimulates extracellular collagen type I degra-dation and reverses myocardial fibrosis in spontaneously hepertensive rats[J].Hypertension,2000,35(6): 1197-1202.

[2]吴剑，邹云增.ACE/AngⅡ/AT1轴与ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴的平衡失调在心血管病中的作用[J].中国医学前沿杂志电子版，2013，5（6）：38-42.

[3]张凌云，王全楚.肝纤维化的诊治进展[J].胃肠病学和肝病学杂志[J]，2012，21（10）：905-908.

[4]申凤俊，朱跃科，贾继东，等.氯沙坦抗大鼠肝纤维化的研究.国外医学消化系统疾病分册，2004，24（6）：381-383.

[5]申凤俊，朱跃科，贾继东，等.缬沙坦抗大鼠肝纤维化疗效及机理的研究[J].中华肝脏病杂志，2004，12（10）：605-608.

[6]史媛媛，申凤俊，杨芳.贝那普利对肝纤维化大鼠ACE2和Ang-（1-7）的影响[J]，中华肝脏病杂志，2011，27（5）：258-260.

[7]张婕，霍丽娟，王晋江，等.奥美沙坦对肝纤维化大鼠Ang（1-7）/Mas受体的影响[J].中华临床医师杂志，2013，7（11）：4893-4897.

[8]Nanthakumar CB,Hatley RJ,Lemma S,et al.Dissecting fibrosis:therapeutic insights from the smallmolecule toolbox[J].Nat Rev Drug Discov,2015,14(10): 693-720.

[9]金国贤，郭庆，蒋雁，等.缬沙坦对肝硬化患者肝纤维化指标的影响[J].实用临床医药杂志，2016，20（3）：142-143.

[10]李旭，宁佐伟，罗薇，等.腹腔持续注射血管紧张素（1-7）对胆管结扎大鼠肝纤维化的抑制作用[J].南方医科大学学报，2012，32（7）：944-947.

[11]Vilas-Boas WW,Ribeiro-Oliveira A,Pereira RM,et al.Relationship between angiotensin-(1-7)and angiotensin II correlates with hemo-dynamic changes in human liver cirrhosis[J].World J Gastroenterol, 2009,15(20):2512-2519.

[12]杨志花，申凤俊，黄会芳.慢性乙型肝炎和肝硬化患者AngⅡ、Ang（1-7）及AngⅡ/Ang（1-7）比值的变化[J].中华临床医师杂志，2016，10（8）：1062-1065.

[13]Osterreicher CH,Taura K,Deminicis S,et al.Angiotensin-converting-enzyme 2 inhibits liver fibrosis in mice[J].Hepatology,2009,50(3):920-938.

[14]Huang ML,Li X,Meng Y,et al.Upregulation of angiotensin-converting enzyme(ACE)2 in hepatic fibrosis by ACE inhibitors[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,2010,37(1):e1-6.

Effects of Benazepril onAng-(1-7)and mRNAof ACE2 and Mas receptor in rats with hepatic fibrosis

Ding Shao-hua,Shen Feng-jun,Wang Li-hua
(Department of Gastroenterology,First Clinical Medical College,Shanxi Medical University,Taiyuan,Shanxi,030001,China)

Objective To observe the curative effect of angiotensin converting enzyme inhibitor benazepril in the treatment of liver fibrosis,to study the effect of benazepril on the expression ofAng-(1-7)and concentration of mRNAofACE2 and Mas receptor in liver tissue of rats with hepatic fibrosis.MethodsThe rat model with hepatic fibrosis was induced by carbon tetrachloride(CCl4),meanwhile rats in treatment group were given benazepril for eight weeks by gastric gavage.The liver tissue was done with hematoxylin-eosin(HE)and Masson trichroe staining.The concentration of AngⅡand Ang-(1-7)was determined by enzyme linked immunosorbent assaynd enzyme linked immunosorbent assay.The level of mRNA of ACE2 and Mas receptor in liver tissue was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.ResultsAt sixth and eighth weeks of the experiment,the degree of hepatic fibrosis in benazepril treated group was lower than that in model group;the concentration of Ang II of liver homogenate in the treatment group than those in the model group decreased(P＜0.05),the concentration of Ang-(1-7)of liver homogenate in the treatment group than those in the model group increased(P＜0.05),the ratio of Ang II/Ang-(1-7)of liver homogenate in the treatment group than those in the model group decreased(P＜0.05);the level of mRNA of ACE2 and Mas receptor in the treatment group was significantly higher than that in the model group(P＜0.05).ConclusionBenazepril significantly attenuated the degree of hepatic fibrosis,and it may by decreasing the concentration of AngⅡ，increasing the concentration of Ang-(1-7),that is Ang II/Ang-(1-7)ratio decreased,and may also associated with increased expression of ACE2 and Mas receptor.

Liver fibrosis;Benazepril;Ang II;Ang-(1-7);ACE2;Mas receptor

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.15.007