银翘散加减对手足口病CA16病毒全基因组表达谱的影响

张泽渊, 杨宏仁

(云南省楚雄医药高等专科学校, 云南 楚雄, 675005)



银翘散加减对手足口病CA16病毒全基因组表达谱的影响

张泽渊, 杨宏仁

(云南省楚雄医药高等专科学校, 云南 楚雄, 675005)

目的 探讨银翘散加减对柯萨奇病毒A组16型感染手足口病恒河幼猴细胞基因表达谱的影响。方法 30只SPF级恒河幼猴，按照随机数字表法分为治疗组(15只)和对照组(15只)，治疗组以银翘散加减方保留灌肠，对照组不进行治疗。连续7 d后样本的全基因组表达谱进行PCA分析。研究2组患者基因表达谱的差异，并对差异基因行Venn 图分析、分层聚类分析和基因本体论GO分析。结果 通过基因组表达谱共筛选到894个差异表达基因，明显上升和下调2个大类。差异表达基因参与的富集的分子包括: 许多炎性趋化因子、参与细胞通讯、细胞周期、免疫系统过程、转录调节和代谢过程等生物学过程的因子。结论 2组基因表达谱存在明显差异，差异表达基因所涉及的生物学过程与中药减轻CA16引起的炎性趋化、免疫系统反应等有相关性。

手足口病; 银翘散; CA16; 基因表达谱

手足口病(HFMD)是一种全球性的疾病, 本病属于中医学“温病学”范畴[1], 其易感人群主要是5岁以下幼儿。近年来对于HFMD的研究大多数集中于肠道病毒71型(以下简称EV71)的感染。临床上，柯萨奇病毒A组16型(以下简称CA16)感染所致HFMD患者一旦发展到重症阶段，其基本情况和临床症状特征基本与EV71感染病例一致[2]。尽管 EV71 灭活疫苗已经上市，但缺乏CA16灭活疫苗[3], CA16感染所致HFMD也需要治疗。本文从病毒学和免疫学、分子生物学、细胞生物学等方法，通过全基因组谱分析CA16所致疾病的的基因表达，为CA16 感染的中药防治研究开拓思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料

30 只SPF级恒河幼猴[由于恒河幼猴与5 岁以下幼儿体质相似故可选用，购自中国医学科学院医学生物学研究所灵长类实验动物中心(滇实动证第2015006号]。体质量3.6～4.8 kg, 3～4个月周龄，分为治疗组与对照组，15只/组，雌雄兼用。动物饲养于生物安全Ⅲ级实验室[许可证号: SYX(滇)2012-0004]。给予自然光照、空气、食物、水、玩具，温度控制在(25±1) ℃，湿度42%～74%。采用喷雾吸毒方式，即模拟正常情况下呼吸道感染方式，CA16 感染组接种滴度为 4.7 lg CCID 50/mL的病毒液 1 mL, 随后每天观察所有动物的临床症状及相关指标。常规饲养检测相关指标; 治疗组以银翘散加减方保留灌肠，处方如下: 金银花、连翘、板蓝根、炒栀子、玄参、藿香(后下)、紫草、桔梗、太子参各 10 g, 荆芥穗、淡豆豉、薄荷(后下)8 g, 生石膏 20 g, 黄连、牛蒡子3 g, 生甘草6 g。每剂煎至200 mL备用。每只恒河幼猴灌肠量25～35 mL; 治疗组恒河幼猴每天灌肠1次，连续7 d, 造模成功后对照组不进行治疗。

1.2 仪器与方法

分离恒河猴血液中的PBMC，稀释血样、分离淋巴细胞、吸取 PBMC 层作为标本，采用细胞培养板、培养瓶; 无酶枪头及无酶离心管、MEM 培养液、PBS 缓冲液、1%胰酶、4%EDTA、Gene Expression Hybridization Kit、Recombinant RNase Inhibitor、Low Input Quick Amp Labeling Kit，One-Color、定制引物、基因芯片。按照 Agilent 表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，在滚动杂交炉中杂交cRNA上样量 1.65 μg，并在洗缸中洗片。完成杂交的芯片采用 Agilent Microarray Scanner 进行扫描，设置 Dye channel。用 Feature Extraction software 10.7读取数据，最后用 Gene Spring Software 11.0 处理(Quantile算法)SBC分析、Venny图、差异表达基因的分层聚类分析、Gene Ontology分析。

1.3 观察指标

通过PCA芯片数据、差异性表达基因、分层聚类及GO分析，研究治疗组和对照组间的差异。

1.4 统计学方法

采取SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析处理，计数资料以百分数(%)表示，采用卡方检验，两样本均数比较用独立样本t检验，组间各时间点的比较采用单因素方差分析，组间相关采用直线相关分析，伯豪公司提供的在线 SAS系统，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CA16感染恒河猴幼猴不同时间点的PCA

分析

从图1可知，病毒感染前，中药治疗组聚集在同一象限内，对照组在其他象限，对照组病毒感染样本明显离散在其余各组之外。

图1 治疗组与对照组的PCA芯片数据

2.2 CA16感染恒河猴幼猴不同时间点差异性表达基因

和治疗前比较差异基因的数目, 2组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组不同时间点差异基因的数目比较(和治疗前比较差异基因的数目)

2.3 CA16感染恒河猴幼猴不同时间的分层聚类及GO分析

分析显示，各个时间点内用中药治疗存在特异性的改变，将图2、3的表达趋势在表2中显示可得差异基因分析表。治疗组和对照组基因表达存在显著差异(P<0.05), 见表2。

图2 分层聚类(注红代表上调、蓝代表下调)

图3 基因组GO分析

表2 差异基因分析表

“+”表示上调, “-”表示下调。

3 讨 论

本实验发现CA16感染恒河猴幼猴后，在对照组中许多参与了CA16感染导致的炎症反应趋化因子(CXCL系列)的表达量发生了显著改变[4]，应用中药的治疗组以上因子较对照组出现明显下调(CXCL1、2、9、10、11), 提示中药可减轻CA16引起的炎性反应。另外，与炎症反应相关的细胞因子及炎症因子包括 IL(6、8、18、1A)的表达量[5]在CA16感染后对照组中都发生了显著变化，说明 CA16 感染激活宿主的免疫系统，从而导致炎症反应的发生。而应用中药组的炎症反应相关的细胞因子及炎症因子包括IL(6、8、18、1A)的表达量[6]在 CA16感染后和感染前相比变化较小，说明应用中药后CA16感染虽然能够激活宿主的免疫系统，从而导致炎症反应的发生，但是不能引起较强的炎症反应。将上述的这些差异性表达基因经过GO分析[7]后显示，在细胞通讯、细胞周期、免疫系统过程、转录调节和代谢过程等生物学过程中，中药能够影响病毒对宿主的代谢反应，进而调节宿主的免疫以及减轻炎症反应的发生。CA16感染恒河猴幼猴的全基因组分析中发现，在感染后的不同时间点，应用中药和不用中药均具有不同的差异性表达基因，说明随着时间的变化, CA16感染后应用中药治疗与不治疗存在特异性。

银翘散源于《温病条辨》[8], 既有辛透之功，又具解毒之效[9], 为温病学中较为常用的方剂，通过一系列的加减可加强其此方面的疗效。CA16感染手足口病导致死亡的原因中，肺水肿、肺出血引发的中枢神经系统病变等，都离不开炎性反应的发生[10]。名方银翘散具有较强的抗炎作用，因此研究此方对防治HFMD引发严重病例及死亡病例有重要意义[11], 从研究中发现温病学中银翘散在HFMD治疗中存在巨大价值与作用的分子基础。

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Effect of modified yinqiao powder on whole genome spectral expression in monkey with hand-foot-mouth disease induced by CA16 virus

ZHANG Zeyuan, YANG Hongren

(ChuxiongMedicalandPharmaceuticalCollege,Chuxiong,Yunnan, 675005)

Objective To investigate effect of modified yinqiao powder on the expression of gene profiling in monkey with hand-foot-mouth disease infected by CA16 cells of genomics. Methods Thirty SPF Ganges river young monkey were randomly divided into treatment group (n=15) and control group (n=15). The monkeys in treatment group were treated with yinqiao powder, while the monkeys in control group were treated nothing. After 7 days, sample gene expression profiles were analyzed by PCA. The gene expression patterns between two groups were studied. Results Totally 894 differentially expressed genes were screened by gene expression profiles, which were significantly clustered into 2 major types. Differential expression of genes involved in the enrichment of molecular function, including many inflammatory chemokines expression, cell communication, cell cycle, regulation of the immune system process, transcription and metabolism process of biological process. Conclusion There are significant differences in the gene expression profile of ovarian granulosa cells between the two groups. The biological processes involved in the differential expression of genes are related to the effects of yinqiao powder on CA16 induced inflammatory chemotaxis and immune system response.

hand-foot-mouth disease; yinqiao powder; CA16; gene expression profile

2017-01-09

中医科学院重大创新、综合性中药新药研究开发技术大平台建设项目(2014ZX9301-007)

R 511

A

1672-2353(2017)09-126-03

10.7619/jcmp.201709033