“珍珠-25”味丸对小鼠心脏组织VEGF基因mRNA的影响研究

韩光明 特格喜白音 杭呼格吉乐

内蒙古自治区国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特 010065



“珍珠-25”味丸对小鼠心脏组织VEGF基因mRNA的影响研究

韩光明 特格喜白音 杭呼格吉乐

内蒙古自治区国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特 010065

目的：研究蒙药“珍珠-25”味丸对小鼠心脏与动脉VEGF基因mRNA的作用。方法：蒙药“珍珠-25”味丸溶液以2次/d，连续给药4周后把小鼠断颈处死，取小鼠心脏用TRIzol法提取总RNA。然后设计小鼠VEGF基因响应引物，利用qPCR技术监测蒙药“珍珠-25”味丸作用下的小鼠心脏VEGF基因mRNA变化。结果：各组小鼠VEGF mRNA 的表达水平在低剂量、中级量、高剂量组与对照组相比明显增加，中剂量组和高剂量组差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论：蒙药“珍珠-25”味丸对小鼠心脏与动脉VEGF基因mRNA有调控作用。

蒙药；心血管疾病；VEGF

心脑血管疾病是危害人类健康最严重的一类疾病，发病因素包括：肥胖、胰岛素抵抗、糖代谢异常、凝血因子升高、慢性炎症、睡眠呼吸障碍等；此外与年龄、性别、家族史、吸烟、高血压、糖尿病、脂代谢紊乱等也有一定的关系。最近研究表明血管内皮细胞生长因子(VEGF)对于许多心血管疾病有着重要的生物学意义和临床意义[1-2]。VEGF以血管内皮细胞为特异性靶细胞，对一些伴有血管内皮损伤的心血管疾病具有较好的实验治疗作用，面临临床应用的过渡。VEGF对侧枝血管形成、动脉粥样硬化病变、血管通透性、血管损伤后的修复及肿瘤形成的影响极为突出[3,6,7]。VEGF是迄今为止发现的唯一特异性促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子，由于内皮细胞增殖是血管形成的重要部分，故VEGF可在新生血管的形成过程中发挥重要作用，因此对心血管疾病具有潜在的治疗意义[8-10]。

蒙医认为心脑血管病属于蒙医学“脉管病”范畴，主要机制是机体在外因的作用下使体内三根元素与七素平衡紊乱，使之心血管功能产生数到质的变化。蒙医学在治疗心血管疾病的过程中创建了许多良好的方子[4]。其中，二十五味珍珠丸是蒙医经典方剂，始载于公元8世纪的藏医古典巨著《四部医典》中，以珍珠、珍珠母、诃子、余甘子等25味药按君臣佐使等原则组成，是蒙医治疗“黑脉病”(相当于西医心脑血管病和半身不遂的总称)的传统验方。为开窍剂，具有安神开窍的功效，用于中风、半身不遂，口眼歪斜、昏迷不醒、神志紊乱、谵语发狂等疾病。蒙药“珍珠-25”味丸是名老蒙医陈玉良教授用来治疗心脑血管疾病的良方，该制剂用于临床40多年疗效明显。虽有良好的治疗效果，但其具体的作用机制并不明确。研究以蒙药“珍珠-25”味丸治疗心血管疾病为实验依据，研究蒙药“珍珠-25”味丸对血管内皮功能基因VEGF的保护作用，从而进一步探讨蒙药“珍珠-25”味丸对血管内皮功能异常对动脉粥样硬化(AS)发病机制的影响[4-5]。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Leica 200M 2000 解剖显微镜(Nikon)，Ti-U型倒置显微镜，TRACE1300-ISQ LT气质联用仪，实时定量PCR仪(美国Applied Biosystems 7500)， 2720-PCR仪(Applied Biosystems)。

1.2 实验动物 BALB/c小鼠(北京华阜康生物科技有限公司)，雄性，4～6周龄，体重18～20 g，无特定病原体(SPF)级饲养。

2 方法

2.1 动物分组及给药 选取培养至第10-14d的BALB/c 小鼠，随机分为空白组(生理盐水)、蒙药“珍珠-25”味丸各剂量(低剂量100μM；中剂量200μM；高剂量500μM)组，2次/d，连续灌胃4周后把小鼠断颈处死，解剖取出心脏放入液氮保存。

2.2 TRIzol法RNA的提取 利用TRIzol法提取小鼠心脏的总RNA，为清除残留的基因组DNA，每个RNA 样本中加入10U DNaseⅠ(Takara，日本)37℃孵育30min。3个RNA 样本的浓度被测定后，每个样本各取10μg等量混合组成1个RNA 池(RNA pool，共30μg)。接着使用Oligotex mRNA Midi Kit(Qiagen，德国)分离纯化样品mRNA。整个流程RNA 的质量和含量通过使用Nanodrop ND-1000(LabTech，美国)检测吸光度 (A260/A280)进行测定, RNA 的完整性通过1.2%的凝胶电泳进行检测，然后-80℃保存备用。

2.2.1 RNA浓度测定 RNA浓度=(OD260-OD320)×稀释倍数×0.04μg/μL。OD230，260，280，320分别是盐浓度、核酸、蛋白质等有机物和背景(溶液混浊度)的吸光度值。

2.2.2 RNA 凝胶电泳实验 ①取出提前制备好的琼脂糖凝胶，将凝胶放入电泳槽。加入1×TAE缓冲液恰好过胶面约1mm即可。②先加10μL Marker于点样孔中，注意不要将凝胶弄破。③在各样品中加入2μL，充分混合后，取10μL于点样孔中。④接通电源，使样品槽在负极端，用15v/cm的电压，电泳30min时间。⑤电泳结束后，将含EB的凝胶直接放在凝胶成像分析系统上，打开抽屉灯箱拍照观察。操作需在暗室观察。

2.3 RT-PCR验

2.3.1 引物设计 ①β-ACTIN上游引物：5' -CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3'；下游引物：5'-CCATCTCCTGCTCGAAGTCT3-'。②VEGF上游引物：5'-CCATGAACTTTCTGCTCTTC-3'；下游引物：5'-GGTGAGAGGTCTAGTTCCCGA-3'。

2.3.2 试剂配制及PCR ① RNA 1μg； Olig 1μL； dNTP2μL； dH2O 6μL。反应温度：65℃ 5min；4℃min。②上述反应液 10μL；5×primer script buffer 6μL；RNase inhibitor 1μL; Reverse TranscriptasexL 1μL； dH2O 4μL。反应温度：42℃ 30min； 72℃ 15min;4℃ 5min。③10×buffer2μL；MgCl2 1.2μL； dNTP 0.4μL； Tag 0.3μL； dH2O 13.5μL；primer1 0.2μL；primer2 0.2μL； SYSB 1μL；cDNA 1μg；反应温度：95℃ 5min；95℃ 15sec；58℃ 20sec；68℃ 1min。

2.4 数据处理 数据采用SPSS12.0软件进行统计学分析，计量资料以表示组间比较，采用t检验；率的比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 小鼠心脏总RNA的提取 利用TRIzol方法提取小鼠心脏总RNA，然后用微量分光光度计测定RNA浓度，用0.8%的凝胶进行RNA电泳实验。由图1可知，本次提取总RNA的实验非常成功，箭头所指部位是RNA的双条链条。

3.2 小鼠VEGF基因引物的设定 引物又名引子，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。另外，在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。本次实验根据β-actin和VEGF基因序列设计了两对β-actin引物和两对VEGF引物，利用PCR实验验证了β-actin和VEGF基因的扩增实验。结果表明VEGF(2)和β-actin(1)的扩增情况良好。见图2。

3.3 对小鼠心脏VEGF基因mRNA变化的影响 各组小鼠VEGF mRNA 的表达水平在低剂量、中剂量、高剂量组与对照组相比明显增加，中剂量组和高剂量组差异均具有统计学意义(P<0.01)。结果如图3。

4 讨 论

心脑血管疾病严重威胁人类健康，50岁以上中老年人较为常见，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位[11]。传统蒙药“珍珠-25”味丸具有安神开窍作用，常用于治疗心肌炎、心绞痛、心肌梗塞、心律失常(心动过速、心律不齐)、先天性心脏病、风湿性心脏病及动脉硬化症等。该药组方简洁合理，药源广泛易得。将其原剂型研究改进成胶囊剂，为本品的质量稳定、服用方便、充分发挥疗效奠定了良好基础，但制备工艺有待进一步提高完善。“珍珠-25”味丸颁布标准尚缺含量测定鉴别项目，且质量标准亟待进一步深入研究，以保证为临床提供一种质量稳定可控的、疗效确切的、安全无毒或低毒的、具有民族特色的蒙药新制剂。

[1]胡国恒，胡哲，盛望，等.益气活血方对大鼠缺血心肌血管新生及HGF影响的研究[J].中国中医急症，2013，22 (9)：1478-1479.

[2] 姚静，戴国华，刘宁，等.益气活血中药对大鼠缺血心肌微血管内皮细胞血管新生功能的影响[J].世界中西医结合杂志，2015，10 (7)：922-926.

[3]张丽娇，董军，陈文祥.卵磷脂胆固醇酰基转移酶与动脉粥样硬化性心血管病[J].中国动脉硬化杂志，2016，8：845-849.

[4] 图娜拉，珠拉。蒙药“珍珠-25”味对动脉粥样硬化大鼠血脂代谢的影响[J].北方药学，2014，11(4)：22-23.

[5] 万德卡.藏药25味珍珠丸治疗坐骨神经痛[J].中国民族医药杂志，1997，12 (3)：26-28.

[6] 顾钰霞，刘乃丰.内皮祖细胞在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的作用研究进展[J].东南大学学报(医学版)，2014，33 (3)：354-358.

[7] 衷敬柏，董绍英，王阶，等.2689例冠心病心绞痛证候要素的文献统计分析[J].中医药信息学，2006，13 ( 5 )：100-101.

[8] 张秋雁，邓冰湘.冠心病心绞痛临床中医证型分布的回顾性分析[J].中医研究，2005，18 (11)：23-24.

[9] 杨雷，毛秉豫，徐国昌，等.黄芪和丹参提取物配伍对大鼠心肌梗死后心肌组织病理变化的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013，19 (8)：175-179.

[10] 陈卫星，吉中强，纪文岩.活血化瘀中药与冠心病血管新生[J].辽宁中医药大学学报，2010，12 (5)：135-136.

[11]李秀清.心脑血管疾病的因素及预防方法分析[J].亚太传统医药，2012，08(01)：179-181.

Study on Mongolian medicine Pearl Pill -25 effect on mRNA VEGF gene in mouse heart tissue

HAN Guangming Tegexibaiyin HANG Hugejile

Inner Mongolia International Mongolian Hospital,Hohhot 010065,China

Objective Analysis of effect of Mongolian medicine Pearl -25 Pill on mice heart and arterial VEGF gene mRNA.Methods We prepared the Mongolian medicine Pearl Pill -25 solution with 2d administered continuously for 4 weeks after the mice were sacrificed the mice heart by TRIzol method to extract total RNA.Then the mouse VEGF gene response primer was designed.Finally, using the mouse heart VEGF gene mRNA qPCR technology to monitor the change of Mongolian medicine Pearl Pill under -25.Results The expression level of VEGF mRNA in each group was significantly lower than that in the control group, the middle dose group and the high dose group had statistical significance (P<0.01). Conclusion The Mongolian medicine Pearl -25 pill could regulate mouse cardiac and arterial VEGF gene mRNA.

Mongolian Medicine； Cardiovascular Disease；VEGF

内蒙古卫纪委科研计划项目(201301014)。

韩光明(1969-)，男，蒙古族，主任医师，研究方向为心血管疾病。E-mail:tegexibaiyin@yeah.net

R29

A

1007-8517(2017)09-0034-03

2017-03-03 编辑：陶希睿)