共培养体系下不同培养时间对奶山羊乳腺上皮细胞功能基因表达的影响

木合依扎·热很别克，邵 伟，余 雄

（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

遗传育种与繁殖

共培养体系下不同培养时间对奶山羊乳腺上皮细胞功能基因表达的影响

木合依扎·热很别克，邵 伟，余 雄

（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052）

为提高奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能基因的表达量，采用分离培养至P3代的1月龄健康萨能奶山羊乳腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞并按2∶1的接种比例混合培养0、24、48、72、96、120、144和168 h（每个处理设置3个重复）后收集细胞，以QPCR检测各时间段SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因的表达量，比较不同培养时间对奶山羊乳腺上皮细胞SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因表达量的影响。结果表明：共培养体系下培养时间影响奶山羊乳腺上皮细胞中SREBP、ST T5A 基因的表达量，却对F BP3A 基因表达量没有影响。说明共培养体系下奶山羊乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养72 h时乳腺上皮细胞泌乳功能基因的表达量最佳。

共培养；乳腺上皮细胞；骨髓间充质干细胞；功能基因

由于乳腺功能的重要性，人们对其整体及细胞功能的研究较早，乳腺细胞的增殖和分化始终贯穿于乳腺发育及泌乳过程，因此，在细胞水平上研究乳腺上皮细胞增殖及分化的调控是非常有意义的［1］。乳腺上皮细胞具有特殊的分泌乳汁的功能，泌乳期大量乳汁的分泌主要是由这些具有分泌活性的乳腺上皮细胞完成［2-4］。乳腺上皮细胞泌乳相关功能基因是奶山羊乳腺上皮细胞中直接影响泌乳性能的基因组，其基因表达是奶山羊乳腺发育状况的标志。

乳脂和乳蛋白是乳中主要成分，是评估乳及乳产品的感官指标。乳脂由甘油三酯和少量的甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸和视黄醇组成［5］。乳中甘油三酯主要有两个来源，一是从外周循环血液中吸收的脂肪酸；二是通过乳腺分泌细胞合成。乳中乳蛋白含量受许多因素的影响，如遗传、生理阶段、环境、疾病及饲养方式等［6］，乳腺是一个合成蛋白质十分活跃的场所，乳蛋白的合成仅在乳腺上皮细胞中进行。而乳腺中 FABP3、SREBP、STAT5基因就是调控乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白的关键基因。梁梦瑶［7］采用基因过表达和基因沉默技术，验证了FABP3基因在奶牛乳腺上皮细胞中的功能，发现FABP3基因表达的变化可调控乳脂合成重要调节分子蛋白的表达，证明FABP3具有调控乳脂合成的功能。催乳素入胞后引起转录因子STAT5的酪氨酸磷酸化，酪氨酸磷酸化的STAT5再与乳蛋白基因上的结合位点结合。当糖皮质激素和催乳素同时存在时，STAT5和GR两者结合形成复合物，可增强对靶基因的诱导作用［8］。因此，本研究通过共培养技术不同培养时间检测奶山羊乳腺上皮细胞SREBP、FABP3、STAT5基因的表达量，从而为确定间充质干细胞与体细胞共培养对乳腺上皮细胞泌乳功能基因表达量的最适时间提供依据。

1 材料

1.1 样品

从1月龄健康萨能奶山羊的乳腺组织中分离乳腺上皮细胞（BMEC）和骨髓中提取骨髓间充质干细胞（BMSCs），将乳腺上皮细胞（BMEC）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）经3代纯化培养。

1.2 仪器及试剂

二氧化碳培养箱、倒置显微镜、低速离心仪、Benchmark酶标仪、六孔板，SYBR®Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（takara）；PrimeScriptTMRTMasterMix（PerfectRealTime）（takara）；MX3000P实时荧光定量PCR仪（Stratagene，US）。

1.3 试验设计

本试验采用分离培养至P3代的1月龄健康萨能奶山羊乳腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞，按2∶1的接种比例混合培养0、24、48、72、96、120、144和168 h（每个处理设置3个重复）后收集细胞，以QPCR检测各时间段SREBP、STAT5、FABP3基因的表达量，比较不同培养时间对奶山羊乳腺上皮细胞SREBP、STAT5、FABP3基因表达量的影响。

1.4 方法

1.4.1 奶山羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离、纯化参考解放军兰州军区兰州总医院全骨髓法制备大鼠骨髓间充质干细胞方法，无菌采集1月龄雌性萨能奶山羊股骨，剔除肌肉、筋膜、骨膜、软骨等，用吸有培养液的一次性注射器冲出骨髓。采用percoll密度梯度离心法纯化细胞［9］。将分离纯化的细胞培养至P3代。

1.4.2 奶山羊乳腺上皮细胞（BMEC）的分离、纯化 参考张以涛等［10］的乳腺上皮细胞分离、纯化及传代方法，培养纯化至P3代。

1.4.3 奶山羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）和乳腺上皮细胞（BMEC）的混合培养 将培养至P3代生长状态良好的BMEC和BMSCs混合培养，10%FBS、5%CO2、37℃下培养，每48小时换液一次。

1.4.4 不同培养时间乳腺上皮细胞泌乳基因表达量的测定1.4.4.1细胞回收和总RNA的提取检测 奶山羊乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞按2∶1的接种比例混合培养至0、24、48、72、96、120、144和168 h时收集细胞，并进行总RNA的提取。用何彦林［11］的细胞收集方法与马杰等［12］的总RNA的提取方法。之后用全自动酶联免疫分析仪测出RNA浓度以及OD260/OD280值，检测其纯度。

1.4.4.2 引物合成和实时荧光定量PCR 各基因引物由上海博谷丁生物科技公司合成。SREBP基因引物序列为F（上游引物）：5′-TCTGGAGGCATCGCAAGC-3′，R（下游引物）：5′-GAGGTTCCAGAGGAGGCTACA-3′，产物大小为 149 bp；STAT5基因引物序列为 F（上游引物）：5′-CAGTGGTTTGACGGGGTGA-3′，R（下游引物）：5′-TCCAGGCGATGGTGATGC-3′，产物大小为181bp；FABP3基 因 引 物 序 列 为 F（上 游 引 物）：5′-CTCACCCTAAAAACACACAGCAC-3′，R（下游引物）：5′-GTGAACAAGTTTCCCTCCATCC-3′，产物大小为135bp。

PCR反应条件体系：PCR Master Mix 10μL，上游引物（20 pmol/μL）0.08 μL，下游引物（20 pmol/μL）0.08 μL，cDNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 IU/μL）0.4 μL，ddH2O加至20 μL。

PCR扩增条件：95℃预变性3 min；95℃变性12 s；59℃退火40 s；72℃延伸45 s；重复循环40次。扩增结束后自动分析融解曲线，确定PCR产物的特异性。将各基因的荧光定量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进一步验证扩增片段的特异性和扩增片段长度。

1.5 统计分析方法

荧光定量的数据用△Ct值表示，ΔCt=Ct（目的基因）－Ct（GAPDH）。所得的2-△△Ct值经SPSS18.0中的ANOVA过程进行单因子方差分析。

2 结果与分析

2.1 DNA完整性检测结果

用1%的琼脂糖凝胶电泳和全分光光度计检测提取总RNA模板。如图1所示，试验提取的基因组DNA模板质量良好、纯度高、不需要纯化，可直接用作模板DNA。

2.2 乳腺上皮细胞SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因QPCR产物特异性

熔解曲线如图2～4所示，PCR产物均为单一峰，梯度模板熔解曲线十分集中，扩增曲线均已光滑。说明没有引物二聚体并扩增产物特异。

图1 DNA完整性检测结果

图2 FABP3基因扩增曲线与溶解曲线

图3 SREBP基因扩增曲线与溶解曲线

图4 STAT5基因扩增曲线与溶解曲线

2.3 共培养体系下不同培养时间BMEC泌乳功能基因表达量的比较

由表1可见，乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养体系下不同培养时间乳腺上皮细胞SREBP基因与ST T5A 基因表达量差异显著（P＜0.05），混合培养体系下乳腺上皮细胞SREBP基因表达量在24～96 h时显著高于其他时间段（P＜0.05），其中72 h时的表达量最高，96 h开始表达量随着时间的延长而下降；乳腺上皮细胞STAT5基因表达量在72～120 h时显著高于24～48 h时的表达量（P＜0.05），其中72 h时的表达量最高；而不同培养时间F BP3A 基因的表达量差异均不显著（P＞0.05）。

表1 混合培养体系下不同的培养时间对BMEC功能基因表达量的影响

3 讨论

本试验结果表明，在不同培养时间条件下奶山羊乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养时，乳腺上皮细胞SREBP基因与ST T5A 基因表达量在72 h时与其他时间段存在显著差异（P＜0.05），而F BP3A 基因表达量在不同时间点均差异不显著（P＞0.05）。通过3种基因表达量图分析，当共培养72 h时SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因表达量均最高。可能的原因是骨髓间充质干细胞适应共培养环境并开始旁分泌等功能的激活需要一段时间，当共培养72 h时细胞生长旺盛，分泌的细胞因子较多，使调控通路得到实现，细胞表面的受体从而与周围的环境更加有效作用，为细胞因子的调控提供了条件。细胞的形态形成与其功能性是密切相关的，在共培养体系下观察两种细胞的形态观察结果也发现，混合培养72 h时两种细胞形态更接近于细胞最佳形态，因此基因的表达量得到最佳状态。而72 h后细胞也慢慢开始进入凋亡时期，骨髓间充质干细胞的功能开始表现降低，细胞的腺泡结构不再完整，除此之外，共培养72 h之后共培养细胞的密度也越来越高，不利于细胞的增殖、分化，所以共培养72h时乳腺上皮细胞泌乳功能基因的表达量最高。本试验中乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养不同的时间，对乳腺上皮细胞F BP3A 基因表达量无显著影响，是因为骨髓间充质干细胞分泌的细胞因子能抑制F BP3A 基因表达量，使其表达量不显著（P＞0.05）。

王立文等［13］在奶牛乳腺上皮细胞与脐带间充质干细胞共培养的试验研究中表明，奶牛乳腺上皮细胞与脐带间充质干细胞共培养至72 h时目的细胞的增殖、分化等最佳。顾劲扬［14］在骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养研究试验中提出，肝细胞与骨髓间充质干细胞2∶1组成的最适共培养体系培养至第2天时有望为今后BAL的构建提供理想细胞材料。这些研究结果与本试验结果相符，所以奶山羊乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养至72 h时乳腺上皮细胞泌乳功能基因的表达量为最佳。

4 小结

共培养体系下培养时间影响BMEC中SREBP、STAT5基因的表达量，却对FABP3基因的表达量没有影响。表明共培养体系下奶山羊BMEC与BMSCs混合培养72 h时乳腺上皮细胞泌乳功能基因的表达量最佳。

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［13］王立文.奶牛乳腺上皮细胞和奶牛脐带间充质干细胞共培养的试验研究［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2014.

［14］顾劲扬.骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养的实验研究［D］.南京：南京医科大学，2009.

Effects of Different Culture Time on Gene Expression of Mammary Gland Epithelial Cell in Dairy Goat under Co-culture System

Muheyizha·Rehenbieke，ShaoWei，Yu Xiong
（College ofAnimal Science，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

In order toimprove the expression oflactation genes in mammarygland epithelial cells ofdairygoats,the mammarygland epithelial cells and bone marrowmesenchymal stemcells were cultured in a ratio2∶1，the expression ofSREBP，ST T5A and F BP3A were detected byQPCR at 24，48，72，96，120，144，168 h（three replicates per treatment）.The results showed that the culture time of co-culture system affected the expression of SREBP and ST T5A gene in dairy goat mammary gland epithelial cells，but had no effectonF BP3A geneexpression.Accordingtotheresults，theexpressionoflactationgeneinmammaryglandepithelialcellsafter72h ofmixedculturewasthebest.

co-culture；mammaryepithelialcell；mesenchymalstemcell；functionalgene

S827.2

A

2095-3887（2017）03-0001-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.001

2017-03-24

新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题（2015KL018）；2015年国家自然基金（31560645）；农业部现代奶产业体系（cars-37）；中国博士后基金委资助作者简介：木合依扎·热很别克(1991-)，女，硕士研究生。

余雄，教授，博士生导师，主要从事动物营养与饲料的教学与研究工作。