仙人掌总RNA提取方法的改进与分析

余乃通，周启林，罗志文，胡福初，张治礼，刘志昕

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 海口 571101；2.海南省农业科学院热带果树研究所/海南省热带果树生物学重点实验室，海南 海口 571100）

仙人掌总RNA提取方法的改进与分析

余乃通1，周启林1，罗志文2，胡福初2，张治礼2，刘志昕1

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 海口 571101；2.海南省农业科学院热带果树研究所/海南省热带果树生物学重点实验室，海南 海口 571100）

利用亚硫酸钠分别与TRIzol试剂、RNA plant plus Reagent试剂、BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂、艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂和OMEGA Plant RNA试剂结合的方法，均可获得高质量的仙人掌茎总RNA。反转录成cDNA，RT-PCR结果显示，5种方法提取的总RNA反转录后均能特异性扩增到matK基因。使用TRIzol试剂盒、RNA plant plus Reagent试剂盒和艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取RNA质量相对较高，在cDNA以1∶100稀释时能检测到matK基因；而使用BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒或OMEGA Plant RNA试剂盒时，灵敏度稍低，在cDNA以1∶10稀释时，能检测到目的基因。利用亚硫酸钠结合不同植物总RNA提取试剂盒进行比较研究，为后续制备仙人掌茎高质量cDNA文库及其分子生物学研究奠定基础。

仙人掌；RNA提取；RT-PCR；灵敏度检测

仙人掌（Opuntia stricta （Haw.） Haw. var. dillenii （Ker-Gawl.） Benson）是仙人掌科仙人掌属的一种常见观赏性双子叶植物，别名有观音掌、霸王、火掌等。仙人掌属多年生植物，肉质灌木，呈茎柱状、球状或扁平状，肉质带刺，叶退化［1］。仙人掌具有喜光、耐热、耐旱和耐瘠等特点，其最适生长温度为20～30℃，主要生长在热带和亚热带地区，在中国主要分布在南方各地区，如云南、贵州、四川、广东、海南等省份。

仙人掌可用作园艺观赏植物［2］、可药用［3］、可食用［4-5］。随着科学技术的发展，越来越多的仙人掌提取物被分离出来，各提取物质的药理作用也被人们进一步认识。但是，仙人掌病害的发生及产生的各种黄化、枯死、腐烂、菌斑及其产生的毒害性代谢物是制约仙人掌产业发展的首要因素之一。因此，对仙人掌及其病原的检测提出很高的要求，其中的关键之一是提取高质量总RNA，为构建cDNA文库、RTPCR、分子杂交和基因克隆等分子生物学研究提供基本保障。

用于植物总RNA提取的方法已有大量研究［6-8］和报道［9-10］。热带、亚热带植物组织含有丰富的多糖、多酚等次生物质，氧化后能与RNA不可逆的结合，是较难提取高质量RNA的主要限制因素之一。而亚硫酸钠可作为还原剂，在植物组织中添加微量就能很好的防止植物体内多酚与空气中的氧气氧化。本试验通过亚硫酸钠分别结合5种不同公司的试剂盒产品，即TRIzol试剂盒、RNA plant plus Reagent试剂盒、BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒和OMEGA Plant RNA试剂盒，对仙人掌茎组织样品进行总RNA提取，电泳结果表明，亚硫酸钠结合各种试剂盒产品均能很好的从仙人掌茎组织样品中提取高质量总RNA（虽然有差异）；利用仙人掌的matK基因进行RT-PCR和灵敏度检测也证明这一点。本研究利用亚硫酸钠结合不同植物总RNA提取试剂盒进行的比较研究，为后续制备仙人掌高质量cDNA文库及其分子生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

仙人掌倒卵形部位（茎）采自海南省海口市城西镇，于-80℃冰箱保存。

主要试剂：亚硫酸钠购自广东西陇化工股份有限公司；TRIzol Reagent （Invitrogen），RNA plant Reagent（天根），BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（百泰克），EASY spin Plus 植物RNA快速提取试剂盒（艾德莱），Plant RNA Kit （OMEGA）分别购自不同生物试剂公司；反转录酶Easy script RT购自全式金生物技术有限公司；2×HSTM Mix购自艾德莱生物科技有限公司；所用的水为DEPC处理水；所用的离心管、枪头均为已去RNA酶的Axygen进口产品，研钵经180℃高温处理6 h以上。

1.2 仙人掌总RNA提取方法

1.2.1 TRIzol方法 称取0.5～1.0 g仙人掌茎样品，加入微量固体亚硫酸钠，于液氮中研磨成粉末，置于1.5 mL的离心管中；向粉末中加入1 mL TRIzol，摇匀，室温放置5 min；4℃条件下12000 r/min离心5 min，取上清液到新的1.5 mL离心管中，加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置5 min；4℃条件下12000 r/min离心15 min，将上层水相转移到新的1.5 mL的离心管中，加入500 μL的异丙醇，摇匀，室温放置10 min；4℃条件下12000 r/min 离心10 min，弃上清液，加1 mL 70%酒精洗涤沉淀；4℃条件下12000 r/min 离心5 min，弃上清液，干燥后加40 μL DEPC水溶解。

1.2.2 天根RNA plus Reagent法 称取0.5～1.0 g仙人掌茎样品，加入微量固体亚硫酸钠，于液氮中研磨成粉末，提取方法参照其说明书，最后用40 μL DEPC水溶解。

1.2.3 BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒 称取0.5～1.0 g仙人掌茎样品，加入微量固体亚硫酸钠，于液氮中研磨成粉末，提取方法参照其说明书，最后用40 μL DEPC水溶解。

1.2.4 EASY spin Plus 植物RNA快速提取试剂盒 称取0.5～1.0 g仙人掌茎样品，加入微量固体亚硫酸钠，于液氮中研磨成粉末，提取方法参照其说明书，最后用40 μL DEPC水溶解。

1.2.5 OMEGA Plant RNA试剂盒 称取0.5～1.0 g仙人掌茎样品，加入微量固体亚硫酸钠，于液氮中研磨成粉末，提取方法参照其说明书，最后用40 μL DEPC水溶解。

1.3 cDNA的合成

利用5种试剂盒提取的仙人掌总RNA为模板，分别进行第一条链cDNA的合成：在0.2 mL去RNA酶的离心管中加入Random primer 2 μL、dNTPs 2 μL、Oligo（dT）18primer 2 μL、5 ×Es RT Buffer 4 μL、反转录酶Easy script RT 0.5 μL、RNase-Free H2O 4.5 μL、总RNA 5 μL，混匀，瞬间离心；42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min反应后，冰上放置3 min；然后瞬间离心，cDNA样品于-20℃冰箱保存。

1.4 RT-PCR及灵敏度检测

根据已报道的扩增仙人掌matK基因引物matK-F和matK-R［11］，对5种试剂盒（结合亚硫酸钠）制备的cDNA进行RT-PCR检测及灵敏度检测。取cDNA产物1 μL作为模板，上游和下游引物各0.5 μL （10 μM），2×HSTM Mix 10 μL，加灭菌去离子水至20 μL，进行PCR 扩增。PCR扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s；72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸5 min。取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。

对上述5种试剂盒制备的cDNA分别以10的倍数进行梯度稀释，包括原液100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。取各稀释浓度溶液1 μL作为模板，分别以matK-F和matK-R引物对它们进行PCR扩增，进行灵敏度分析。扩增体系和反应条件均与上面一致，取5 μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测，分析5种试剂盒制备的cDNA灵敏度的差异。

2 结果与分析

2.1 仙人掌茎总RNA提取及凝胶电泳分析

取5 μL总RNA样品与1 μL核酸染料混匀，在1%琼脂糖凝胶电泳上检测，结果见图1。从图1可以看出，5种试剂盒制备的仙人掌总RNA点样孔都比较干净，没有亮斑，说明这些总RNA都没有明显的蛋白质和多糖污染；进一步发现，这些总RNA也无明显的DNA污染。比较图1的5个电泳图，发现RNA plant Reagent试剂盒（图1B）和BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（图1C）提取的总RNA条带相对较亮和清晰，28 S条带明显比18 S条带亮，且条带之间没有弥散现象，说明这两种试剂盒提取的质量较好。TRIzol试剂盒（图1A）、EASY spin Plus 植物RNA快速提取试剂盒（图1D）和OMEGA Plant RNA试剂盒（图1E）提取的仙人掌总RNA条带亮度相对较弱，28 S条带和18 S条带亮度基本一致，浓度相对较低，并且图1E出现轻微弥散的现象。不使用亚硫酸钠结合试剂盒的方法提取仙人掌总RNA，结果见图2，从图2看出总RNA提取质量较差。

图1 利用亚硫酸钠结合5种植物总RNA提取试剂盒制备仙人掌总RNA

图2 不使用亚硫酸钠结合5种植物总RNA提取试剂盒制备仙人掌总RNA

2.2 RT-PCR检测

根据仙人掌内标基因matK的保守引物进行RT-PCR检测，是验证仙人掌RNA质量的标准之一。将RT-PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果（图3）显示，利用亚硫酸钠结合5种植物总RNA提取试剂盒的方法，均能成功扩增仙人掌matK基因，条带特异，与预期大小一致。

图3 不同总RNA提取方法的RT-PCR检测

2.3 灵敏度检测

将5种试剂盒制备的、不同稀释度的cDNA分别进行RT-PCR灵敏度检测，结果见图4。比较发现，5种试剂盒来源的cDNA样品，其PCR的灵敏度是存在差异的。比较图4A～E，发现RNA plant Reagent试剂盒来源的cDNA PCR灵敏度检测最高（图4B），可以达到10-4；其次为TRIzol试剂盒和艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒，其cDNA PCR灵敏度检测可以达到10-3；而BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒和OMEGA Plant RNA试剂盒来源的cDNA PCR灵敏度最低，只有10-2（表1）。

表1 仙人掌提取的总RNA质量和灵敏度相关性分析

图4 不同RNA提取方法的仙人掌cDNA灵敏度检测

3 结论与讨论

植物组织体内核酸的提取是分子生物学研究的基础，大多数的植物特别是热带、亚热带植物组织中含有丰富的多糖、多酚等次生物质，氧化后能与RNA不可逆的结合，因此很难从其组织中提取高质量的RNA［12］。目前，报道植物总RNA的提取方法有很多，不同公司来源的试剂盒也多种多样。但是，多糖多酚氧化后与RNA不可逆结合仍然制约着植物高质量RNA的制备。由于不同植物自身特点的差异，一种RNA提取方法难以适用于多种植物，同种植物不同组织的RNA提取方法也大不相同［13-17］。所以本实验通过亚硫酸钠分别结合不同公司的试剂盒产品：即TRIzol试剂盒、RNA plant plus Reagent试剂盒、BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、艾德莱EASY spin Plus 植物RNA快速提取试剂盒和OMEGA Plant RNA试剂盒等5种方法分别对仙人掌组织样品进行总RNA提取，结果表明，亚硫酸钠结合各种试剂盒产品均能很好地从仙人掌组织样品中提取总RNA（虽有差异），利用matK基因进行RT-PCR和灵敏度检测也证明这一点。

TRIzol法是比较保守和常用的植物总RNA提取方法，该法适合多种植物，应用较为广泛，是此类实验的首选；而其他4种试剂盒产品也是国内科研工作者比较常规的方法。前期实验表明，不添加亚硫酸钠的情况下，对仙人掌组织样品进行液氮研磨，RNA沉淀变为褐色，说明多糖多酚氧化后与RNA结合。本试验结果表明，在研磨前添加微量的亚硫酸钠，能预防植物体内代谢物质氧化，大量减少多糖多酚、蛋白质和DNA等污染，从而保证获得高质量的植物总RNA。

本研究还发现，提取的仙人掌茎总RNA质量与matK基因RT-PCR的灵敏度整体上呈相关性。虽然BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒制备的总RNA质量较高，但是matK基因的灵敏度仅为10-2，可能原因是RNA中含有内源或外源RNaseA污染。其他4种试剂盒制备的总RNA质量与灵敏度呈相关性。本研究利用亚硫酸钠结合不同植物总RNA提取试剂盒进行比较研究，为后续制备仙人掌高质量cDNA文库及其分子生物学研究奠定基础。

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（责任编辑 杨贤智）

Improvement and analysis of cactus total RNA extraction method

YU Nai-tong1，ZHOU Qi-lin1，LUO Zhi-wen2，HU Fu-chu2，ZHANG Zhi-li2，LIU Zhi-xin1
（1. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou 571101，China；2 Institute of Tropical Fruit Tree，Hainan Academy of Agricultural Science，Hainan Key Laboratory of Tropical Fruit Biology，Haikou 571100，China）

High-quality total RNAs of cactus stem were obtained by using Na2SO3with each of TRIzol reagent，RNA plant plus reagent，BioTeke total RNA extraction reagent，EASY spin Plus plant RNA extraction reagent（Aidlab） or OMEGA plant RNA reagent. The cDNA RT-PCR and specific detection results showed that matK gene fragments were amplified by five total RNA extraction methods. The cDNAs that reverse transcribed from the TRIzol reagent，RNA Plant Plus Reagent，and EASY spin Plus Plant RNA Extraction reagent （Aidlab） were relatively high，as the sensitivity PCR of cDNA highest dilution to 1∶100. While the cDNAs that reverse transcribed from BioTeke total RNA extraction reagent and OMEGA plant RNA reagent were relatively low，as the sensitivity RTPCR indicated the cDNA highest dilution to 1∶10. In this study，Na2SO3combined with different plant total RNA extraction kits to prepare high quality of RNA is the key of cactus stem cDNA library preparation and molecular biology.

cactus；RNA extraction；RT-PCR；sensitivity detection

S682.33

A

1004-874X（2017）03-0075-05

2017-01-19

海南省热带果树生物学重点实验室开放课题（KFZX2017002）；海南省自然科学基金（20153130）

余乃通（1985-），男，在职博士生，助理研究员，E-mail：yunaitong@163.com

刘志昕（1963-），男，博士，研究员，E-mail：liuzhixin@itbb.org.cn

余乃通，周启林，罗志文，等.仙人掌总RNA提取方法的改进与分析［J］.广东农业科学，2017，44（3）：75-79.