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实时荧光定量PCR检测非小细胞肺癌组织中SP70的表达及意义

2017-06-06梁祥森陈波宁宇韩胜富陈军冯震

中国实用医药 2017年12期
关键词:定量良性荧光

梁祥森 陈波 宁宇 韩胜富 陈军 冯震

【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中SP70抗原的表达及意义。方法 选取40例肺癌组织作为肺癌组[NSCLC 32例(NSCLC组), 小细胞肺癌8例(小细胞肺癌组)], 另取20例良性病变肺组织作为肺良性病变组, 采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)相对标准曲线法检测各组中SP70抗原表达的相对水平, 定量分析其与临床组织病理学特征的关系。结果 肺癌组SP70平均表达水平为(1.798±1.275)pmol/μl, 明显高于肺良性病变组的(0.921±0.238) pmol/μl, 差异有统计学意义(P<0.05);NSCLC组 SP70平均表达水平为(2.334±1.268)pmol/μl, 高于小细胞肺癌组的(1.171±1.286)pmol/μl, 差异有统计学意义(P<0.05);SP70表达水平与患者性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度均无关 (P>0.05)。结论 SP70可能是评价NSCLC的一个潜在的指标。

【关键词】 SP70抗原;非小细胞肺癌;实时荧光定量聚合酶链反应

DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.12.030

寻求肺癌早期检测指标及方法是目前研究热点, 近期有研究发现一株能特异性识别NSCLC的McAbNJ00l, 此抗体对NSCLC的免疫性诊断和治疗意义重大, 其所针对的靶抗原为相对分子质量70000的胞浆新抗原SP70, SP70与NSCLC关系密切[1]。本研究采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)相对标准曲线法检测40例肺癌组织和20例良性病变肺组织中SP70的表达水平, 分析其表达与临床组织病理学特征的关系, 评价其在临床诊治中的应用价值。

1 材料与方法

1. 1 材料来源 本院2014年8月~2015年6月手术切除的肺癌组织40例作为肺癌组, 其中NSCLC 32例(NSCLC组), 小细胞肺癌8例(小细胞肺癌组)。另取20例手术切除的肺良性病变组织作对照(肺良性病变组), 均由病理确诊, 标本收集后立即保存于-80℃冰箱。Trizol液和逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司。TSYBR GreenI荧光染料:北京天根公司。引物由北京诺赛基因公司设计并合成, 目的基因SP70 F: 5′- CCAGTTCAAGTGCTCGG CAT-3′;R: 5′- TTGCTC TTGGAACCTCGGAC-3′。内参β-actin F: 5′-GTGACGTTGACATC CGTAAAGACC-3′;R:5′-CTAG GAGCCAGGGCAGTAATCT -3′。荧光定量PCR仪:Step one V2.1(美国ABI公司)。

1. 2 方法

1. 2. 1 总RNA提取及cDNA合成 按Trizol裂解抽提法提取总RNA, 常规检测其纯度、浓度及完整性, 将RNA逆转录合成cDNA后存放-20℃冰箱备用。

1. 2. 2 标准曲线的制备 将PCR产物目的条带通过吸附柱式琼脂糖DNA回收法进行回收纯化, 测其浓度后再以10倍系列梯度进行连续倍比稀释成106~101 copies/μl数量级的标准品, 进行实时荧光定量PCR扩增生成标准曲线。

1. 2. 3 相对标准曲线法实时荧光定量PCR扩增 每份标本均扩增SP70和β-actin, 20 ul反应体系:SYBR GreenI reaction mixture:10 ul, 目的基因(10 pmol/μ1)上、下游引物各0.4 μl, cDNA模板2 μl, ddH2O:17.2 μl。反应条件:95℃预变性2 min, 然后95℃20 s, 60℃30 s, 68℃45 s共40个循环, 按PCR仪默认条件进行溶解曲线分析, 每份标本重复3次, 通过扩增曲线及溶解曲线判定结果是否是阳性。

1. 2. 4 数据的标化处理 以同一样本β-actin模板量为参照, 标化计算SP70的相对模板数, 即:SP70/β-actin。

1. 3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 荧光定量PCR评价指标 SP70标准曲线线性关系良好。见图1。扩增效率R2>0.998, 溶解曲线只有一个单峰。见图2。特异性高, PCR产物在>87.0℃以上获得单一熔解峰, 经琼脂糖电泳后所得产物是目的基因SP70所要扩增的条带。

2. 2 实验结果 肺癌组SP70平均表达水平为(1.798±

1.275)pmol/μl, 明顯高于肺良性病变组的(0.921±0.238) pmol/μl,

差异有统计学意义(P<0.05);NSCLC组SP70平均表达水平为(2.334±1.268)pmol/μl, 高于小细胞肺癌组的(1.171±

1.286)pmol/μl, 差异有统计学意义(P<0.05);SP70表达水平与患者性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度均无关 (P>0.05)。见表1。

3 讨论

相关研究[1-3]指出SP70是一种针对NSCLC的特异性蛋白靶标, 其存在于癌细胞的胞膜和胞浆, 可促进癌细胞增殖, 是肺癌检测诊断的分子靶标, 同时也是抗肺癌治疗靶点, SP70对于肺癌的诊治意义重大。彭蘡等[3]采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测NSCLC患者中外周血液中SP70的表达, 结果发现NSCLC组SP70阳性率明显高于对照组, 提示SP70可能是诊断NSCLC的潜在血清肿瘤标志物。亦有研究[4-6]发现恶性胸腔积液中SP70的检出率明显增高, 而且NSCLC患者胸腔积液中SP70检出率高于小细胞肺癌患者, 再次证实了SP70与NSCLC的密切关系。截止目前, 肺癌组织中SP70 mRNA表达的相关研究报道不多, 采用实时荧光定量PCR双标准曲线法进行检测尚未见报道。实时荧光定量PCR具有极高的灵敏度、特异性, 能精确分析微量物质的基因表达水平, 而双标准曲线相对定量法可避免实验中各基因扩增效率不相等导致的实验误差, 保证了实验数据的准确性。

本研究发现, 肺癌组SP70平均表达水平为(1.798±

1.275)pmol/μl, 明显高于肺良性病变组的(0.921±0.238) pmol/μl,

差异有统计学意义(P<0.05);NSCLC组 SP70平均表达水平为(2.334±1.268)pmol/μl, 高于小细胞肺癌组的(1.171±

1.286)pmol/μl, 差异有统计学意义(P<0.05)。与彭蘡等[3]研究结论一致, 进一步证实了SP70与NSCLC的密切关系, 提示SP70可能是诊断NSCLC的潜在指标。本实验中内参β-actin在各检测样本中均阳性表达, 保证了实验数据的可靠性, 但多数基因是通过蛋白的表达发挥作用, 从mRNA到蛋白中间翻译、修饰过程中可能造成mRNA/蛋白水平倒置现象, 本实验检测的mRNA基于基因水平, 需后续实验进一步验证[7]。由于本研究样本量较少, 随访时间短, 未能发现P70的表达与肺癌预后的关系, 有待于加大样本量, 加强随访, 同时监测SP70在外周血液中的表达情况, 可能会发现SP70与肺癌预后的关系。另外, SP70抗原在胞浆中和胞膜上均有表达, 胞浆中表达量更豐富, 抗癌药物的作用靶点更为广泛, 其潜在临床意义重大。

综上所述, SP70可能是评价NSCLC的一个潜在的指标, 但其作用机制仍有待于进一步研究探讨。

参考文献

[1] Pan S, Wang F, Huang P, et al. The study on newly developed McAb NJ001 specific to non-small cell lung cancer and its biological characteristics. Plos One, 2012, 7(3):e33009.

[2] 徐婷, 潘世扬, 王芳, 等. 抗人非小细胞肺癌单克隆抗体的制备及鉴定. 临床检验杂志, 2011, 29(3):216-218.

[3] 彭蘡, 潘世扬, 王芳, 等. 非小细胞肺癌患者血清中SP70的检测及其临床意义. 中华检验医学杂志, 2012, 35(6):554-558.

[4] 邓石雄, 刘映云, 李尔凡, 等. SP70检测在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的临床应用价值. 中国实验诊断学, 2014(5):746-748.

[5] 张丹华. SP70抗原在癌性胸腔积液鉴别诊断中的临床应用价值. 医学综述, 2015, 21(10):1865-1866.

[6] 杨瑞霞, 潘世扬, 王芳, 等. 良恶性胸腔积液鉴别中SP70检测的临床意义. 中华检验医学杂志, 2012, 35(12):1150-1154.

[7] 陈铭伍, 梁祥森, 冼磊. 非小细胞肺癌中MTA1基因的表达及意义. 江苏医药, 2012, 38(15):1761-1763.

[收稿日期:2017-02-03]

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