生防枯草芽孢杆菌210发酵工艺优化

邹高溪，赵春田，裘娟萍

(浙江工业大学 生物工程学院，浙江 杭州 310014)

生防枯草芽孢杆菌210发酵工艺优化

邹高溪，赵春田，裘娟萍*

(浙江工业大学 生物工程学院，浙江 杭州 310014)

采用响应面法，优化抗真菌的枯草芽孢杆菌210的发酵工艺，提高芽孢产量。结果显示，影响芽孢产量最主要的3个因素为玉米粉、蛋白胨和KH2PO4用量，最佳发酵培养基配方为：玉米粉10.75 g·L-1、黄豆粉9.00 g·L-1、蛋白胨6.97 g·L-1、KH2PO40.66 g·L-1、NaCl 4.00 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.60 g·L-1、CaCl23.00 g·L-1、MnSO4·H2O 0.60 g·L-1。基于优化配方通过单因素优化试验，确定最佳发酵条件为：培养温度31 ℃、装液量30 mL·250 mL-1、接种量4%。枯草芽孢杆菌210在上述优化后的条件下培养，芽孢产量达到1.64×1010cfu·mL-1，较优化前提高6.5倍。

枯草芽孢杆菌；发酵工艺；响应面法

植物病害是造成农业损失的主要因素之一，目前生产上主要采用化学农药防治。化学农药的不当使用可能引发严重环境问题，破坏生态平衡，威胁农产品安全[1]。作为一种替代方案，利用微生物(生防菌)防治植物病害在近年来受到越来越多的关注[2-3]。

枯草芽孢杆菌是一种优良的生防菌，它能够产生多种抗菌物质，这些抗菌物质对人畜安全，对环境无污染，且不易产生抗药性，加之枯草芽孢杆菌本身具有生长快、营养简单、芽孢抗逆性强的特点，十分有利于生防菌的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖[4]。目前，枯草芽孢杆菌作为生防菌已经在生产中得到应用：含有枯草芽孢杆菌的微生物农药“百抗”对水稻纹枯病的防效达70%以上；武汉天惠生物工程有限公司开发的枯草芽孢杆菌Bs-208杀菌剂是多种植物病原菌的竞争性抑制剂[5]。研究发现，不同枯草芽孢杆菌菌株在营养需求方面存在显著差异，通过对培养基和发酵条件的优化能够快速有效地提高相应菌株的芽孢产量[6]。笔者所在实验室团队前期分离筛选得到1株枯草芽孢杆菌210，对常见的植物病源真菌具有良好的拮抗作用。本研究拟应用响应面分析法优化枯草芽孢杆菌210产芽孢发酵培养基，采用单因素试验法优化发酵条件，旨在提高芽孢产量，为生防菌210的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌种及培养基

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)210，浙江工业大学微生物研究所保藏。

1.1.2 培养基

斜面及平板计数培养基(g·L-1)：葡萄糖10.00，蛋白胨10.00，牛肉膏5.00，NaCl 5.00，琼脂15.00～20.00，pH值7.0(灭菌前)，115 ℃灭菌30 min。

种子培养基(g·L-1)：葡萄糖5.00，蛋白胨5.00，NaCl 5.00，MgSO4·7H2O 0.20，KH2PO40.20，pH值7.0(灭菌前)，115 ℃灭菌30 min。

发酵培养基(g·L-1)：玉米粉12.00，黄豆粉6.00，蛋白胨4.00，NaCl 4.00，MgSO4·7H2O 0.40，KH2PO40.40，CaCl22.00，MnSO4·H2O 0.60，pH值7.0(灭菌前)，121 ℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 培养条件

斜面培养条件：用接种环在甘油管中取枯草芽孢杆菌210在斜面上划线接种进行活化，37 ℃恒温培养24 h。

种子培养条件：将活化的枯草芽孢杆菌210接种到种子培养基中，装液量30 mL·250 mL-1，200 r·min-1，37 ℃培养12 h。

发酵培养条件：按4%接种量将种子液接种到装液量50 mL·250 mL-1发酵培养基中，200 r·min-1，37 ℃培养72 h。

1.2.2 细胞数及芽孢数测定

发酵液于80 ℃水浴加热30 min后，采用稀释平板菌落计数法[7]测定芽孢数，每个稀释度平行重复3次。

1.3 培养基优化

1.3.1 Plackett-Burman(PB)设计

取玉米粉(A)、黄豆粉(B)、蛋白胨(C)、NaCl(E)、MgSO4·7H2O(F)、KH2PO4(G)、CaCl2(I)、MnSO4·H2O(J)作为PB试验设计的8个因素，每个因素取高低2个水平，低水平(-1)为初始发酵培养基中的浓度，高水平(+1)取低水平的1.5倍(表1)。选用n=12的Plackett-Burman设计表，以单位体积发酵液芽孢数为响应值。

1.3.2 最陡爬坡试验设计

取PB设计试验结果确定的3个因素进行最陡爬坡试验，以各显著因素的正负效应确定最陡爬坡试验的方向，以适当的浓度梯度改变为变化步长，快速逼近最大响应区域。

1.3.3 Box-behnken设计

以PB试验筛选得到的3个因素为设计因素，以最陡爬坡试验得出的浓度作为中心点，分别取高(+1)、中(0)、低(-1)3个水平进行Box-behnken设计，以发酵液单位体积芽孢数作为响应值，利用Design Expert 8.05b软件对试验数据进行回归分析。

1.3.4 验证试验

取最佳培养基配方进行3次平行试验，取平均值，验证模型是否可靠，进而得出最终优化结果。

1.4 发酵条件优化

在优化培养基配方的基础上，分别对枯草芽孢杆菌210的培养温度(28、31、34、37、40 ℃)、接种量(30、40、50、60 mL·250 mL-1)、装液量(2%、3%、4%、5%、6%)等发酵条件进行单因素优化试验。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基主要组分筛选

采用Plackett-Burman法，研究枯草芽孢杆菌210发酵培养基8个组分对芽孢产量的影响，培养72 h后测定发酵液中芽孢产量，结果见表1。应用Minitab 17软件对试验结果进行数据分析，各组分所代表的高低水平及其方差分析结果见表2。

由表1和表2可知，培养基组分对芽孢产量影响显著的3个因素为：A(玉米粉)、C(蛋白胨)和G(KH2PO4)，这3个因素对芽孢产量(Y)的影响可用回归方程Y=3.62-0.42A+0.53C+0.37G表示，该回归方程的决定系数R2=0.998 3，大于0.95，说明回归方程拟合程度良好。

2.2 最陡爬坡试验结果

依据Plackett-Burman试验结果，选择玉米粉、蛋白胨、KH2PO4进行爬坡试验，以寻找最适的浓度配比。由表2可知，玉米粉对芽孢产量具有负效应，蛋白胨、KH2PO4对芽孢产量具有正效应；因此要提高芽孢产量，应适当降低玉米粉的浓度，提高蛋白胨、KH2PO4的浓度。最陡爬坡试验的设计方案和结果见表3。可以看出，4号试验组的芽孢产量最高，说明在玉米粉10.00 g·L-1、蛋白胨7.50 g·L-1、KH2PO40.75 g·L-1条件下，发酵液中芽孢产量最大。

2.3 响应面分析结果

利用Design-Expert 8.05b软件中的Box-Behnken，选择玉米粉(X1)、蛋白胨(X2)、KH2PO4(X3)进行3水平试验设计(表4)：X1，9.00(-1水平)、10.00(0水平)、11.00(+1水平)；X2，6.50(-1水平)、7.50(0水平)、8.50(+1水平)；X3，0.65(-1水平)、0.75(0水平)、0.85(+1水平)。测定各试验组芽孢产量。

表1 Plackett-Burman试验设计各变量对芽孢产量的影响

Table 1 Effect of variables (in coded levels) in the Plackett-Burman design on spore yield

序号No．ABCDEFGHIJ芽孢Spores/(109cfu·mL-1)1-1-1+1+1+1-1+1+1-1+15 072+1+1-1+1+1-1+1-1-1-13 603-1+1+1-1+1-1-1-1+1+14 374-1-1-1+1+1+1-1+1+1-12 935+1-1+1+1-1+1-1-1-1+13 176+1-1+1-1-1-1+1+1+1-13 337+1-1-1-1+1+1+1-1+1+12 338-1+1-1-1-1+1+1+1-1+14 009-1-1-1-1-1-1-1-1-1-12 1810+1+1+1-1+1+1-1+1-1-13 3011-1+1+1+1-1+1+1-1+1-15 6012+1+1-1+1-1-1-1+1+1+13 50

D、H为虚拟项。

The term of D and H were virtual items.

表2 Plackett-Burman试验设计因子、水平及效应

Table 2 Variables， levels and effects in the Plackett-Burman design

编码Term变量因素Variable水平Level/(g·L-1)(-1)(+1)效应Effect[ (+)- (-)]/6相对置信度RelativeconfidenceT值T⁃valueP值P⁃valueA玉米粉Cornflour12 0018 00-0 8352-10 510 060∗B黄豆粉Soybeanmeal6 009 000 30954 310 157C蛋白胨Peptone4 006 001 06513 400 047∗∗ENaCl4 006 00-0 0128-0 160 898FMgSO4·7H2O0 400 60-0 1352-1 700 338GKH2PO40 400 600 73159 200 069∗ICaCl22 003 000 14251 790 324JMnSO4·7H2O0 600 900 26523 340 185

*和**分别表示P<0.1和P<0.05。

*and**indicatedP<0.1 andP<0.05， respectively.

表3 最陡爬坡试验设计方案及结果

Table 3 Design and results of steepest ascent experiment

序号No．玉米粉Cornflour/(g·L-1)蛋白胨Peptone/(g·L-1)KH2PO4/(g·L-1)芽孢Spores/(109cfu·mL-1)116 003 000 302 70214 004 500 454 37312 006 000 605 63410 007 500 756 7758 009 000 904 47

表4 Box-Behnken试验设计及结果

Table 4 Design and results of the Box-Behnken experiment

序号No．X1X2X3芽孢Spores/(109cfu·mL-1)10007 672-1+105 703+1-106 974-1-105 5050+1+14 8060+1-15 177+10+16 4780-1-18 539-10-16 9310-10+15 0711+1-106 53120007 67130007 60140007 5315+10-17 83160-1+15 50170007 67

应用Design-Expert 8.05b软件对试验数据进行拟合，得到芽孢产量(Y)的多元回归模型：

Y=7.63+0.58X1-0.54X2-0.83X3-0.16X1X2+0.12X1X3+0.67X2X3-0.44X12-1.02X22-0.62X3。

对回归模型进行方差分析，结果见表5。可以看出，玉米粉、蛋白胨和KH2PO4对芽孢产量均具有显著(P<0.05)影响，回归模型P值<0.01，达极显著水平，失拟项的P值<0.000 1，亦达极显著水平，说明所构建的回归模型显著。决定系数R2=0.914 8，大于0.90，说明回归模拟程度好。

为进一步研究相关变量因素之间的交互作用以确定最优点，利用Design-Expert 8.05b软件分析二次回归模型，绘制3个影响因子之间的响应面分析立体图和等高线图(图1)。图中的等高线均呈椭圆形，表明各图中交互作用显著。将多元回归模型中的各自变量(X1、X2、X3)分别求一阶偏导数并均令其为0，得到1个三元一次线性方程组，解此方程组得到模型预测最佳点，玉米粉、蛋白胨和KH2PO4最佳添加量分别为10.75、6.97、0.66 g·L-1，该条件下，模型预测芽孢产量为8.37×109cfu·mL-1。

表5 芽孢产量回归模型的方差分析

Table 5 Analysis of variance (ANOVA) as regression model of spore yield

方差来源Source自由度df平方和Sumofsquares均方差MeansquareF值F⁃valueP值P⁃value模式Model919 852 218 350 0053∗∗X112 562 6510 020 0158∗X212 312 318 750 0211∗X315 505 5020 830 0026∗∗X1X210 100 100 380 5568X1X310 060 060 240 6414X2X311 781 786 730 0357∗X2110 820 823 110 1210X2214 354 3516 490 00481∗∗X2311 601 606 070 0433∗残差Residual71 850 26失拟项Lackoffit31 840 61275 17<0 0001∗∗纯误差Pureerror48 91E⁃0032 23E⁃003所有项Cortotal1621 69

*与**分别表示P<0.05与P<0.01。

*and**indicatedP<0.05 andP<0.01， respectively.

图1 玉米粉、KH2PO4和蛋白胨对芽孢产量影响的响应面分析立体图(左)及相应的等高线图(右)Fig.1 Contour plot analysis (left) and response surface plot analysis (right) into the effects of corn flour， KH2PO4 and peptone on spore yield

2.4 优化结果验证

为验证模型预测的准确性，对响应面优化后的发酵培养基进行3个批次的摇瓶发酵试验，以初始发酵培养基为对照，验证摇瓶发酵结果。芽孢产量分别为7.8×109、8.2×109、8.5×109cfu·mL-1，平均为8.17×109cfu·mL-1，模型预测的最高芽孢产量为8.37×109cfu·mL-1，两者比较接近，与优化前芽孢产量2.19×109cfu·mL-1相比提高了2.7倍。

2.5 培养条件优化

2.5.1 不同培养温度对枯草芽孢杆菌210芽孢产量的影响

如图2所示，31 ℃条件下，枯草芽孢杆菌的芽孢产量最高，达到1.2×1010cfu·mL-1，为枯草芽孢杆菌210产芽孢最适温度。高于31 ℃的温度下，细胞数、芽孢数及芽孢形成率都随着温度提高而降低。

2.5.2 不同装液量对枯草芽孢杆菌210芽孢产量的影响

如图3所示，随着装液量增加，细胞数、芽孢数及芽孢形成率均减少。30 mL·250 mL-1的装液量为枯草芽孢杆菌210菌株产芽孢的最佳装液量，芽孢产量达到1.67×1010cfu·mL-1。这可能是因为该菌株在生长繁殖过程中需要消耗大量的氧，装液量增加会降低溶氧，抑制细胞的生长，从而降低芽孢的形成。但装液量太少则会降低发酵规模增加能耗。

2.5.3 不同接种量对枯草芽孢杆菌210芽孢产量的影响

菌种生长繁殖的速度取决于接种量大小，接种量过大增加生产成本，过小则会延长培养时间，降低发酵生产率。如图4所示，接种量为4%时，枯草芽孢村杆菌210菌株在发酵液中芽孢产量达到1.64×1010cfu·mL-1，过高或过低的接种量下芽孢产量都会降低，因此4%的接种量为枯草芽孢杆菌210产芽孢的最佳接种量。

图2 不同培养温度对枯草芽孢杆菌210芽孢产量的影响Fig.2 Effect of culture temperature on spore yield of Bacillus subtillis 210

图3 不同装液量对枯草芽孢杆菌210芽孢产量的影响Fig.3 Effect of fluid volume on spore yield of Bacillus subtilis 210

图4 不同接种量对枯草芽孢杆菌210芽孢产量的影响Fig.4 Effect of inoculum size on spore yield of Bacillus subtilis 210

3 结论

为提高生防枯草芽孢杆菌210的芽孢产量，降低生产成本，本研究通过Plackett-Burman试验、响应面法对发酵工艺进行优化，优化后的发酵培养基配方为玉米粉10.75 g·L-1、蛋白胨6.97 g·L-1、黄豆粉9.00 g·L-1、KH2PO40.66 g·L-1、NaCl 4.00 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.60 g·L-1、CaCl23.00 g·L-1、MnSO4·H2O 0.60 g·L-1。对比优化前培养基配方，该优化配方降低了玉米粉含量，增加了蛋白胨和KH2PO4含量。验证试验显示，芽孢产量较优化前提高了2.7倍，平均达到8.17×109cfu·mL-1。基于优化后的培养基，通过单因素试验优化发酵条件：培养温度31 ℃、摇瓶装液量30 mL·250 mL-1，接种量4%。应用优化配方及工艺，枯草芽孢杆菌210的芽孢产量达到1.64×1010cfu·mL-1，较优化前提高了6.5倍。试验结果为后续的发酵罐扩大培养提高芽孢产量奠定了基础。

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(责任编辑 高 峻)

Optimization of fermentation technology of biocontrol bacteriumBacillussubtilis210 by response surface analysis

ZOU Gaoxi， ZHAO Chuntian， QIU Juanping*

(CollegeofBiotechnologyandBioengineering，ZhejiangUniversityofTechnology，Hangzhou310014，China)

In order to increase the spore yield， the fermentation technology ofBacillussubtilis210 with antifungal activity was optimized. It was shown that the main factors influencing spore production were doses of corn flour， peptone and KH2PO4. The optimal fermentation medium was as follows: corn flour 10.75 g·L-1， soybean meal 9.00 g·L-1， peptone 6.97 g·L-1， KH2PO40.66 g·L-1， NaCl 4.00 g·L-1， MgSO4·7H2O 0.60 g·L-1， CaCl23.00 g·L-1and MnSO4·H2O 0.60 g·L-1. Based on the single factor optimization experiment results， the optimal culture conditions were as follows∶culture temperature 31 ℃，fluid volume 30 mL·250 mL-1，inoculum size 4%. With the optimal fermentation condition， the spore yield ofBacillussubtilis210 reached 1.64×1010cfu·mL-1， and was increased by 6.5 fold as compared with the spore yield before fermentation technology optimization.

Bacillussubtilis; fermentation technology; response surface analysis

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.16

2016-12-15

浙江省重中之重学科开放研究基金(20150109)

邹高溪(1991—)，男，湖南永州人，硕士研究生，研究方向为应用微生物学。E-mall: 1575392595@qq.com

S482.7

A

1004-1524(2017)05-0799-07

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 799-805

邹高溪，赵春田，裘娟萍.生防枯草芽孢杆菌210发酵工艺优化[J]. 浙江农业学报，2017，29(5)： 799-805.

*通信作者，裘娟萍，E-mall: qiujping@zjut.edu.cn