犬骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

李 捷，白利鹏，陈 曦，杨 芳，沈留红，曹随忠，左之才，任志华，马晓平，余树民

(四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)

犬骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

李 捷，白利鹏，陈 曦，杨 芳，沈留红，曹随忠，左之才，任志华，马晓平，余树民*

(四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)

为了体外高效快捷地分离培养犬(canine)骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)，实验分别用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法对犬BMSCs进行分离培养，利用免疫组化和流式细胞术检测获得细胞的表面标志抗体，并用成骨和成脂方向的诱导分化等方法对其进行鉴定。结果表明，全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法都能成功培养出犬BMSCs，但后者相对前者获得的细胞经培养后其原代细胞分布更均匀，原代培养达到传代所需的时间更短，成活率更高；两种方法获得的P3和P8细胞的生长曲线基本保持一致；免疫组化和流式细胞术检测犬BMSCs表达CD105、CD90和CD29，但是不表达CD34和CD31；且能成功诱导为成骨细胞和脂肪细胞。证明采用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法均能够成功分离和培养犬的BMSCs，而密度梯度离心法是一种较全骨髓差速贴壁法更适合犬BMSCs的分离方法。

犬；骨髓间充质干细胞；分离培养

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一群存在于骨髓腔内的非造血干细胞，具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，在体外不同的诱导条件下能被诱导分化为成骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、内皮细胞、胰岛细胞等各胚层细胞[1-2]，且因其有取材方便和低免疫性等优点，目前被广泛用于细胞及组织多种疾病的替代治疗[3-5]。

目前，关于动物来源的BMSCs研究主要集中于鼠[6-7]、兔[8-9]、马[10-11]、猪[12-13]等实验动物上，其分离培养条件都比较完善，但由于种属差异性的存在，在组织工程骨应用于临床及进行人的病理生理研究前，仍需有其他动物实验数据为之提供理论依据。

随着人们生活水平逐步提高，宠物犬猫的饲养数量越来越多。同时，宠物疾病尤其是犬猫的骨折、骨营养不良性关节病、肝脏或肾脏衰竭等逐渐成为影响宠物生活与生存质量的严重障碍，对这些宠物疾病的研究和临床治疗日益受到动物医学研究者和临床工作者的高度重视，因此我们选择犬的间充质干细胞作为实验的细胞来源。犬来源的间充质干细胞(MSCs)可取材于骨髓[14]、脂肪[15]、脐带[16]、羊水[17]等组织，其分离方法主要包括差速贴壁分离法、密度梯度离心法、酶消化法等。骨髓来源的MSCs因其具有取材方便和较少的伦理道德争议而被广大动物医学研究工作者所接受。但是由于间充质干细胞没有特异性表面抗体，因此干细胞鉴定成为一大难点。相关研究表明，BMSCs易贴壁生长，呈长纤维形，且随着年龄的增长，其自我更新和分化能力逐渐降低[18]，表达CD54、CD44、CD90，不表达组织相容性复合物Ⅱ(MHC-Ⅱ)以及CD34和CD45[19]。本研究利用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法分别分离培养犬BMSCs，并进行了扩增、鉴定及体外向成骨细胞和脂肪细胞的定向分化研究，建立一套较完备而快速的BMSCs培养模式，且证明密度梯度离心法较全骨髓差速贴壁法更适合犬BMSCs的分离培养，可为后续研究及细胞移植治疗提供充足的细胞材料，为下一步的深入研究和干细胞移植奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试动物

1岁龄左右健康中华田园犬6只，购于四川省雅安市。

1.2 主要试剂与仪器

LG-DMEM培养基，GIBCO公司；FBS，HyClone 公司；胰蛋白酶，Sigma公司；CD34、CD31、CD105、CD90、CD29抗体，北京博奥森生物技术有限公司；免疫组化染色试剂盒、浓缩型DAB试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、胰岛素、IBMX、吲哚美辛，sigma分装；超净工作台，苏州净化设备集团有限公司；二氧化碳培养箱，Thermo 公司；倒置相差显微镜，日本Olympus 公司；流式细胞仪，BD Accuri C6。

1.3 实验方法

1.3.1 骨髓液的采集

取1岁龄犬，按体质量肌肉注射犬眠宝，全身麻醉后局部剃毛、消毒，做无菌股骨穿刺，用肝素抗凝，抽取一定量的骨髓液。混匀后平均分为2份。

1.3.2 原代培养方法

将采集的肝素-骨髓液注入15 mL离心管中，110g离心10 min，吸弃上清液，加5 mL PBS，混匀，平均分为2份，编号A、B。各重复离心步骤2～3次。弃上清液。A组采用全骨髓差速贴壁培养法分离BMSCs，即将细胞沉淀直接用细胞培养液(LG-DMEM，10%FBS，1%青链霉素，2 mmol·L-1L-谷氨酰胺)悬浮细胞，计数后以108～109cells·mL-1的密度接种于一次性塑料培养皿中。B组采用密度梯度离心法分离BMSCs，步骤为：将细胞沉淀加适量LG-DMEM混匀，制备细胞悬液，调整细胞密度为2×108～1×109cells·mL-1。沿管壁加入到含等量淋巴细胞分离液的玻璃离心管中，450g离心20～25 min，收集界面雾状的单个核细胞，110g离心10 min，加入适量细胞清洗液漂洗2次，离心，弃上清。用培养液悬浮细胞，计数后以5×106～5×107cells·mL-1的密度接种于培养皿中。两种方法获得的细胞均放置于37 ℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养。72 h后首次换液，之后每3 d换液1次，直到细胞克隆成片后传代。首次换液后，每天在显微镜下仔细观察细胞形态变化。

1.3.3 细胞传代培养和增殖

原代培养细胞达到80%～90%融合时，弃去培养液，用PBS冲洗2次，再用胰蛋白酶(0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA)消化，倒置显微镜下密切观察，见大部分细胞突起回缩，形态变圆，细胞间隙变宽后，立即吸去胰酶，加入细胞培养液终止消化。用移液枪轻轻吹打，至细胞脱落，收集细胞悬液，110g离心10 min，吸除上清，加入新的细胞培养液重悬，按1∶2～1∶3进行传代培养。经2～3 次传代处理后，即得到纯化的BMSCs。

为观察不同培养方法对细胞增殖的影响，取生长良好的第3代(P3)和第8代(P8)细胞，制成细胞悬液， 经计数后， 以3×104cells·mL-1的密度接种至24孔板，每孔接种0.5 mL，在培养箱中培养8 d，每3 d换液一次，每隔24 h取3 孔用血球计数板计数，连续8 d，求每日均值，以接种时间为横坐标、细胞数为纵坐标作图，即为细胞生长曲线，计算对数生长期细胞群体的倍增时间：Td=T×lg2/lg(Nt/N0)。Td，倍增时间(h)；T，细胞数由N0增至Nt所用的时间(h)；Nt与N0分别为t时刻与初始细胞数。

1.3.4 细胞免疫组织化学

取第3代犬BMSCs，调节细胞浓度为105cells·mL-1，接种于96孔板，每孔100 μL培养，待其达到80%汇合，吸弃培养液，PBS 洗涤 2 次，4%多聚甲醛室温固定20 min，吸弃固定液，PBS洗涤3次，过氧化物酶标记的链霉卵白素(Streptavidin/Peroxidase)免疫组化染色试剂盒染色。染色步骤参考说明书。染色结束后显微镜观察并照相。

1.3.5 流式细胞术检测细胞表面标志

取第3 代BMSCs，消化，110g离心10 min，PBS 洗涤 2 次后调节细胞浓度为 1×106cells·mL-1，分为 6 份，各管加细胞洗液漂洗，离心后收集细胞，然后将细胞重悬在含10%山羊血清的孵育缓冲液(含2%BSA的PBS)中，室温封闭10 min。每份分别滴加CD34、CD31、CD105、CD90、CD29 的一抗(以 PBS 代替一抗作为阴性对照)，室温孵育 30 min 后，孵育缓冲液洗涤 2 次，滴加FITC 标记的羊抗兔 IgG，避光反应 40 min 后，重复洗涤2次，离心回收细胞，将所得细胞重悬在适量PBS中，后经流式细胞仪检测细胞表面标志物 CD34、CD31、CD105、CD90 、CD29阳性细胞的表达。

1.3.6 细胞的体外诱导分化

选择生长状态良好的第3代(P3)犬BMSCs，用胰蛋白酶消化2～3 min，制成单细胞悬液，以3×104cells·mL-1密度接种于24孔培养皿中，每孔设3个重复，同时设置对照组。待细胞长至80% 汇合时分别换成成骨诱导液(地塞米松10 nmol·L-1，维生素C 50 μmol·L-1，β-甘油磷酸钠10 mmol·L-1，10%FBS，LG-DMEM)和成脂诱导液(地塞米松1 μmol·L-1，胰岛素10 mg ·L-1，IBMX 0.1 mmol·L-1，吲哚美辛200 μmol·L-1，10%FBS，LG-DMEM)进行成骨和成脂诱导，每3天换液一次。成骨诱导第7天和第21天分别用碱性磷酸酶和茜素红进行成骨细胞染色，成脂诱导14 d用油红O进行脂肪细胞染色。

2 结果与分析

2.1 犬BMSCs的原代培养特征

犬BMSCs全骨髓差速贴壁法原代培养中，接种48 h后，可观察到有少量细胞形态已有所变化，随着时间增加，形态变为长纤维形、多边形等，数量逐渐增多，培养到第6～7天，可见有细胞集落形成，细胞呈螺旋状排列，多数为长纤维形，少数为多角形，但细胞分布不均匀(图1)；密度梯度离心法获得的原代细胞接种48 h后，细胞即出现形态上的改变，呈短梭形或小多角形，折光性较强，第3～5天贴壁细胞增多，并逐渐延伸生长为长梭形，细胞分布均匀，第7天，细胞间界限不清，排列呈漩涡状(图1)。以上结果表明，密度梯度离心法在分离培养原代犬BMSCs时，较全骨髓差速贴壁法用时短，得到的细胞也较均一。

2.2 犬BMSCs的传代培养及生长曲线的绘制

传代后犬BMSCs迅速贴壁，6 h左右细胞全部贴壁，细胞均匀分布，并开始分裂增殖(图2-A/a)。3～4 d 细胞铺满皿底，即可消化传代(图2-B/b)。开始时大多为梭形，增殖速度快，细胞传代周期较短，待传至第9 代时，细胞铺展得宽大而扁薄，胞内颗粒物质增多，增殖速度减慢，细胞传代周期延长(图2-D/d)。两种方法获得的传代细胞的生长特点基本一致。

第3代和第8代犬BMSCs生长曲线分别见图3-1、2。细胞接种后，24 h内为BMSCs细胞潜伏期，数量基本保持不变；此后细胞开始分裂，进入对数生长期，4 d时达到细胞数量峰值；之后细胞数量开始基本保持不变，细胞已进入平台期甚至衰退期。两种方法分离的P3和P8代犬BMSCs生长曲线基本一致，说明细胞传到第8代时，犬BMSCs在体外生长状态良好，在体外仍能稳定增殖。全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法获得的犬BMSCs的增殖曲线基本一致，都保持典型的“S”型曲线，且随着传代次数的增加，细胞生长速度逐渐下降，已不能在体外稳定增殖。

倒置显微镜观察细胞形态特征(100×)，A、B、C为全骨髓差速贴壁培养法培养2、4、8 d分离的原代细胞；a、b、c为密度梯度离心法培养2、4、8 d分离的原代细胞Cellular morphology was observed by inverted microscope (100×); A， B， C were primary cells isolated from whole bone marrow differential velocity adherent after cultured for 2, 4, 8 d， respectively; a， b， c were primary cells isolated from density gradient centrifugation after cultured for 2, 4, 8 d， respectively图1 两种方法分离的原代犬骨髓间充质干细胞比较Fig.1 Comparison of primary canine bone marrow mesenchymal stem cells derived from two methods

倒置显微镜观察细胞形态特征(100×)； A—D为全骨髓差速贴壁法；a—d为密度梯度离心法。A/a，第3代接种 6 h；B/b，第3代培养3.5 d；C/c，传代细胞P7；D/d，传代细胞P9Cellular morphology was observed by inverted microscope (100×); A-D， Cells isolated from whole bone marrow differential velocity adherent; a-d， Cells isolated from density gradient centrifugation. A/a， The 3th cells cultivated for 6 h; B/b， The 3th cells cultivated for 3.5 d; C/c， The 7th cells; D/d， The 9th cells图2 犬骨髓间充质干细胞培养特征Fig.2 Cultural characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells derived from canine

A、B，全骨髓差速贴壁培养法组； a、b，密度梯度离心法组A and B， Whole bone marrow differential velocity adherent; a and b， Density gradient centrifugation图3 犬骨髓间充质干细胞P3、P8生长曲线的比较Fig.3 Growth curves of 3th and 8th canine bone marrow mesenchymal stem cells

2.3 犬BMSCs表面抗原鉴定

细胞免疫组织化学分析显示，犬BMSCs表达CD29、CD90和CD105，不表达CD31、CD34(图4)。流式细胞术检测结果如表1和图5(选取其中一次的流式结果作为代表)。结果表明，2种方法获得的细胞表面标志物表达情况一致，密度梯度离心法所得的细胞间充质干细胞的标志物表达率显著高于全骨髓差速贴壁法，即在犬BMSCs纯化过程中，前者所获得的细胞较后者均一。

2.4 犬BMSCs的体外分化潜能检测

用P3代犬BMSCs进行成骨细胞和成脂细胞的诱导分化。在细胞达到70%汇合后，分别换诱导液。在成骨诱导7 d后，细胞呈短梭形，用碱性磷酸酯酶(ALP)染色呈现阳性细胞(图6-A/a)，而未经诱导的BMSCs染色阴性：诱导21 d，大多数细胞呈鳞片形，堆积形成钙化结节，形成的钙结节茜素红染色为红色(图6-B/b)，未经诱导的无钙沉积物质出现。表明2种分离方法获得的犬BMSCs均成功诱导为成骨细胞，成骨分化能力并无明显差异。

倒置显微镜观察细胞形态特征(100×)。1，对照组；2，CD31；3，CD34；4，CD29；5，CD90；6，CD105Cellular morphological characteristics were observed by inverted microscope (100×). 1， Control; 2， CD31; 3， CD34; 4， CD29; 5， CD90; 6， CD105图4 犬骨髓间充质干细胞免疫组化结果Fig.4 Immunohistochemical results of mesenchymal stem cells derived from bone marrow of canine

表1 犬骨髓间充质干细胞表面标志物的表达率

Table 1 The expression ratio of surface markers of bone marrow mesenchymal stem cells of canine

分离方法Isolationmethod表达率Expressionratio/%CD29CD90CD105CD31CD34全骨髓差速贴壁法Wholebonemarrowdifferentialvelocityadherent89 27±2 2579 53±1 9683 82±1 565 86±0 524 35±0 38密度梯度离心法Densitygradientcentrifugation94 77±2 0789 53±1 8593 87±1 644 90±0 843 63±0 32

A—E为全骨髓差速贴壁培养法；a—e为密度梯度离心法A-E， Whole bone marrow differential velocity adherent; a-e， Density gradient centrifugation图5 犬骨髓间充质干细胞流式细胞术结果Fig.5 Results of mesenchymal stem cells derived from bone marrow of canine by flow cytometry

A/a，碱性磷酸酶染色(100×)；B/b，矿化结节茜素红染色(200×)； C/c，脂滴油红O染色(200×)A/a， ALP staining (100×); B/b， The mineralization crystals by Alizarin red staining (200×); C/c， The lipid droplets by Oil red O staining (200×)图6 犬骨髓间充质干细胞诱导分化结果Fig.6 The differentiation results of mesenchymal stem cells derived from canine bone marrow

在成脂细胞诱导过程中，细胞由长纤维状，逐渐变短，胞质内出现发亮的脂滴，在诱导第15天细胞内脂滴可被油红O染成红色(图6-C/c)，未经诱导的无脂滴出现。结果表明，2种分离方法获得的犬BMSCs均能成功诱导为脂肪细胞，成脂分化能力也无差异。

3 讨论

干细胞根据其来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞，对成体干细胞的研究不像胚胎干细胞一样涉及伦理道德方面的问题。在成体干细胞中，间充质干细胞的研究是当今的热点，典型的MSCs来自于成人的骨髓基质，在新鲜的骨髓中，BMSCs的含量极少，约占有核细胞的0.001%～0.01%[18-19]。

自20世纪70年代Friedenstein等[20]建立BMSCs分离及扩增的方法以来， 人们又提出了多种从骨髓中分离BMSCs的方案， 但对BMSCs的体外分离培养、鉴定还没有统一公认的标准方法；同时，也尚未见有报道探讨不同分离方法对BMSCs体外分离培养的影响。目前，常用于BMSCs 分离的方法有全骨髓差速贴壁筛选法[21]、密度梯度离心法[22]、免疫磁珠法[23]、流式细胞仪分选法[24]等。流式细胞仪和免疫磁珠分选技术虽然可获得高纯度的BMSCs，但对细胞活性和分化能力有较大影响，而且实验条件要求高，需要骨髓量较大[25]。本研究所用的全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法是公认的较常用的分离BMSCs的方法。作为组织工程的种子细胞，细胞的纯度越高越好。全骨髓差速贴壁法是根据BMSCs贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性对二者进行分离[26]，但所得的细胞成分复杂，需经过多次换液才能纯化细胞。密度梯度离心法主要是根据骨髓中各细胞成分比重的不同[18]，利用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，操作上较全骨髓差速贴壁分离法烦琐，得到的细胞数也比后者少，但此方法可排除大量红细胞对BMSCs 贴壁的影响，得到的原代细胞较纯净。

本研究利用全骨髓差速贴壁法和密度梯度离心法分别对犬BMSCs进行分离培养，试验结果表明，经原代培养48 h后，镜下观察可见全骨髓差速贴壁分离法获得的细胞仅有极少量呈细长的长纤维形，密度梯度离心法获得的细胞形态变化的数目明显较前者多，细胞呈短梭形或小多角形，折光性较强；两者达到可传代水平所需的时间，后者也明显较短。细胞融合时都呈纺锤状，体积小而密集，螺旋状或平行排列。通过P3和P8代细胞生长曲线的绘制，发现传代后两者得到的BMSCs体外培养时，增殖迅速，没有明显差异，说明两者得到的BMSCs自我更新能力强。对生长曲线的分析可见，犬BMSCs接种后0～2 d为增殖潜伏期，第3天为指数生长期，第4天进入平台期。经计算，犬BMSCs细胞倍增时间为42 h左右。虽然犬BMSCs在体外容易分离培养并进行多次传代，但在传到10代以后，细胞的生长速度有所下降，说明其体外传代次数也是有限的。

BMSCs 的鉴定问题是目前的难点之一，其原因主要在于对BMSCs 的特异性表面标记物仍存在争议[19]。在体外，BMSCs 以易于贴附于塑料培养板为特征，未分化的基质细胞呈梭形或成纤维细胞形，通常采用其特征性的形态以及分化为其他基质细胞系的功能来鉴定。因此在2005年，ISCT(the International Society for Cellular Therapy)定义了BMSCs 的最低标准：首先，BMSCs 在标准培养条件下必须具备贴塑料壁生长的特点；其次，BMSCs 表达CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或CD11b、CD79a或 CD19 及 HLA-DR 表面分子表达阴性；第三，经体外诱导，BMSCs 必须能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化[27]。本研究结果表明，获得的犬BMSCs符合骨髓间充质干细胞的特点：第一，无论是全骨髓差速贴壁分离法还是密度梯度离心法，获取的BMSCs 开始贴壁生长时，呈短梭形或多角形，具有长短不等的数个细胞突起，在细胞密集区表现为涡旋状，随着培养时间的延长，相互重叠成多层；第二，2种方法分离出的贴壁细胞，经免疫组化和流式细胞术检测结果均表明所得细胞表达CD90和CD105，不表达CD34和CD31；第三，向成骨细胞和成脂细胞分别诱导分化后，用成骨细胞特异标记物(茜素红)及成脂细胞特异标记物(油红O)染色，均出现阳性细胞。综上所述，从犬骨髓中分离和纯化培养获得的贴壁细胞，经细胞形态、膜表面抗原和诱导能力检测，均证明为纯化的BMSCs。本研究为犬BMSCs进一步诱导分化和临床应用研究奠定了基础。

[1] WANG S .Clinical applications of mesenchymal stem cells[J].JournalofHematology&Oncology， 2012， 5(1)：828-829.

[2] 徐丽丽. 成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的研究进展[J]. 中国组织工程研究与临床康复， 2008， 12(8)：1509-1512. XU L L. Differentiation of adult bone marrow mesenchymal stem cells into islet-like cellsinvitro[J].JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearch， 2008， 12(8)：1509-1512. (in Chinese with English abstract)

[3] INTINI G. The use of platelet-rich plasma in bone reconstruction therapy[J].Biomaterials， 2009， 30(28)：4956-4966.

[4] 徐晓斐，王健，徐海艇，等. 组织工程方法修复羊腭裂骨缺损的初步研究[J]. 组织工程与重建外科，2008，4(2)：77-79. XU X F， WANG J， XU H T， et al. A study on tissue-engineered approach of repairing the bony defect: cleft palate of lamb model[J].JouralofTissueEngineetingandReconstructiveSrugery， 2008， 4(2)：77-79. (in Chinese with English abstract)

[5] FIGLIUZZI M， COMOTI R， PERICO N， et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells improve islet graft function in diabetic rats[J].TransplantationProceedings， 2009， 41(5):1797-1800.

[6] SOLEIMANI M， NADRI S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow[J].NatureProtocol， 2009， 4(1)：102-106.

[7] MEHANNA R A， NABIL I， ATTIA N， et al. The effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and their conditioned media topically delivered in fibrin glue on chronic wound healing in rats[J].BiomedResearchInternational， 2015， 2015(1)：110-120.

[8] SAKAI D， MOCHIDA J， IWASHINA T， et al. Differentiation of mesenchymal stem cells transplanted to a rabbit degenerative disc model: potential and limitations for stem cell therapy in disc regeneration[J].Spine， 2005， 30(21)：2379-2387.

[9] 陈晓佩， 于文浩， 王亚丹， 等. 不同分离方法及首次换液时间对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响[J]. 中国兽医学报， 2015， 35(8)：1307-1311. CHEN X P， YU W H， WANG Y D， et al. Effect of different isolation methods and time for first medium exchange on biological characteristics of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J].ChineseJournalofVeterinaryScience， 2015， 35(8)：1307-1311. (in Chinese with English abstract)

[10] 张焱如， 刘宗正， 韦林盖，等. 蒙古马骨髓间充质干细胞的分离培养及多向分化潜能的研究[J]. 畜牧兽医学报， 2011， 42(10)：1357-1361. ZHANG Y R， LIU Z Z， WEI L G， et al. Study of isolation， cultre and multiple differentiation potential of Mongolia horse bone marrow derived mesenchymal stem cells[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica， 2011， 42(10)：1357-1361. (in Chinese with English abstract)

[11] BARBERINI D J， FREITAS N P P， MAGNONI M S， et al. Equine mesenchymal stem cells from bone marrow， adipose tissue and umbilical cord: immunophenotypic characterization and differentiation potential[J].StemCellResearch&Therapy， 2014， 5(1)：297-302.

[12] LEE W J， LEE S C， LEE J H， et al. Differential regulation of senescence andinvitrodifferentiation by 17 β-estradiol between mesenchymal stem cells derived from male and female mini-pigs[J].JournalofVeterinaryScience， 2016， 17(2)：159-170.

[13] 高健，梁桂金，朴英姬，等. 猪骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性[J]. 中国兽医学报，2013，33(5)：788-794. GAO J， LIANG G J， PIAO Y J， et al. Isolation， culture and biological properties analysis of mesenchymal stem cells from porcine bone marrow[J].ChineseJournalofVeterinaryScience， 2013， 33(5)：788-794. (in Chinese with English abstract)

[14] MUIR P， HANS E C， RACETTE M， et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells modulate molecular markers of inflammation in dogs with cruciate ligament rupture[J].PLoSOne， 2016， 11(8)：e0159095.

[15] KIM Y， LEE S H， KANG B J， et al. Comparison of osteogenesis between adipose-derived mesenchymal stem cells and their sheets on poly-ε-caprolactone/β-tricalcium phosphate composite scaffolds in canine bone defects[J].StemCellsInternational， 2016: 8414715.

[16] FILIOLI URANIO M， VALENTINI L， LANGE-CONSIGLIO A， et al. Isolation， proliferation， cytogenetic， and molecular characterization andinvitrodifferentiation potency of canine stem cells from foetal adnexa: A comparative study of amniotic fluid， amnion， and umbilical cord matrix[J].MolecularReptoductionandDevelopmentRevelation， 2011，78(5)：361-373.

[17] KIM E Y， LEE K B， YU J， et al. Neuronal cell differentiation of mesenchymal stem cells originating from canine amniotic fluid[J].HumanCell， 2014， 27(2)：51-58.

[18] 邴爱英， 宋文刚. 骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展[J]. 泰山医学院学报，2011，32(7)：549-552. BING A Y， SONG W G. The progress of isolation， culture and biological properties of mesenchymal stem cells from bone marrow[J].JournalofTaishanMedicalCollege， 2011， 32(7)：549-552. (in Chinese)

[19] CLARK K C， KOL A， SHAHBENDERIAN S. Canine and equine mesenchymal stem cells grown in serum free media have altered immunophenotype[J].StemCellReviewsandReports， 2016， 12(2)：1-12.

[20] FRIEDENSTEIN A J， GORSKAJA J F， KULAGINA N N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J].ExperimentalHematology， 1976， 4(5)：267-274.

[21] BARBERINI D J， FREITAS N P P， MAGNONI M S， et al. Equine mesenchymal stem cells from bone marrow， adipose tissue and umbilical cord: immunophenotypic characterization and differentiation potential[J].StemCellResearch&Therapy， 2014， 5(1)：297-302.

[22] AYATOLLAHI M， TALAEI K T， RAZMKHAH M. Growth suppression effect of human mesenchymal stem cells from bone marrow， adipose tissue， and Wharton’s jelly of umbilical cord on PBMCs[J].IranianJournalofBasicMedicalSciences， 2016， 19(2)：145-153.

[23] 韩圣，夏照帆，韦多，等. 应用免疫磁珠负选法分离与纯化小鼠骨髓间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究，2006，10(41)：28-30. HAN S， XIA Z F， WEI D， et al. Isolation and purification of mesenchymal stem cells of mice with immunomagnetic beads negative selection technique[J].ChineseJournalofClinicalRehabilitation， 2006， 10(41)：28-30. (in Chinese with English abstract)

[24] PHINNEY D G. Isolation of mesenchymal stem cells from murine bone marrow by immunodepletion[J].MethodsinMolecularBiology， 2008， 449∶171-186.

[25] KERENYI F， TARAPCSAK S， HRUBI E， et al. Comparison of sorting of fluorescently and magnetically labelled dental pulp stem cells[J].FogorvosiSzemle， 2016， 109(1)：29-33.

[26] 李鲁生，张涵，王成俊，等. 骨髓间充质干细胞的分离方法和生物学特性[J]. 中国组织工程研究，2010， 14(10)：1869-1873. LI L S， ZHANG H， WANG C J， et al. Isolation methods and biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells[J].JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearch， 2010， 14(10)：1869-1873. (in Chinese with English abstract)

[27] HORWITZ E M， LE B K， DOMINICI M， et al. Clarification of the nomenclature for MSC: the international society for cellular therapy position statement[J].Cytotherapy， 2005， 7(5)：393-395.

(责任编辑 卢福庄)

Isolation， cultivation and identification of canine bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)invitro

LI Jie， BAI Lipeng， CHEN Xi， YANG Fang， SHEN Liuhong， CAO Suizhong， ZUO Zhicai， REN Zhihua， MA Xiaoping， YU Shumin*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

In order to explore which way can be more efficient and faster to isolate， culture and identifiy the canine bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)invitro， the BMSCs were isolatedinvitroby whole bone marrow differential velocity adherent and density gradient centrifugation. Immunohistochemistry and flow cytometry were used to examine the surface markers of the cells， and induced their differentiation into osteoblasts and adipocytes. The results showed that canine BMSCs were successfully cultivated by whole bone marrow differential velocity adherent and density gradient centrifugation. Compared with the former， primary cells from the latter method was more uniform after cultivation， and cost shorter time for primary cells proliferation into full confluency along with higher survival rate. The growth curves of undifferentiated cells in P3 and P8 were similar from the both methods. Immunohistochemistry and flow cytometry showed that CD105， CD90 and CD29 were expressed in the cells and could be induced into osteoblasts and adipocytes， respectively， while CD34 and CD31 were not expressed. These results indicated that canine BMSCs could be isolated and cultivated by the both methods， and the density gradient centrifugation method was better compared to the whole bone marrow differential velocity adherent.

canine; bone marrow mesenchymal stem cell; isolation and cultivation

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.10

2016-11-22

国家自然科学基金(31172379)

李捷(1990—)，女，河南南阳人，硕士研究生，主要从事干细胞与动物生殖生物学研究。E-mail: hnlijiec@126.com

*通信作者，余树民，E-mail:yayushumin@163.com

S829.2；Q2-33

A

1004-1524(2017)05-0751-09

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 751-759

李捷，白利鹏，陈曦，等. 犬骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定[J].浙江农业学报，2017，29(5): 751-759.