靶向鸡Stra8基因的miRNA预测及鉴定

王颖洁，左其生，张良良，张文慧，金 晶，王 飞，纪艳芹，靳 锴，何娜娜，李碧春，张亚妮

(扬州大学 动物科学技术学院 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏 扬州 225009)

靶向鸡Stra8基因的miRNA预测及鉴定

王颖洁，左其生，张良良，张文慧，金 晶，王 飞，纪艳芹，靳 锴，何娜娜，李碧春*，张亚妮*

(扬州大学 动物科学技术学院 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏 扬州 225009)

为克隆如皋黄鸡Stra8基因的3’UTR，寻找靶向Stra8基因的microRNA(miRNA)，以鸡精原干细胞的cDNA为模板，根据NCBI数据库Stra8的CDS序列设计引物，通过3’RACE技术克隆Stra8基因的3’UTR，并构建相应的荧光素酶表达载体和突变载体；利用生物学预测软件对靶向Stra8 3’UTR的miRNA进行预测，选择评分最高的miRNA进行慢病毒载体构建；以pRL-TK为内参，分别将miRNA与Stra8 3’UTR荧光素酶表达载体和突变载体共转染DF-1细胞，利用双荧光素酶基因报告系统对miRNA进行活性检测。结果表明，采用3’RACE技术成功克隆Stra8 基因的3’UTR；Targetscan生物在线软件预测到靶向Stra8基因的4个特异性较高的miRNA，并成功构建其相应的慢病毒载体；双荧光素酶活性检测结果显示，gga-miR-1a、gga-miR-31、gga-miR-218均可通过3’UTR序列抑制Stra8基因的表达，其中gga-miR-31抑制效果最佳。该结果可为后续深入探讨gga-miR-31介导调控的Stra8基因在雄性生殖细胞分化中的调控网络提供依据。

鸡；miRNA；Stra8；gga-miR-31；双荧光素酶活性检测系统

Stra8(stimulated by retinoic acid gene 8)基因是Bouillet等[1]从小鼠全能的P19 胚胎癌细胞中筛选出的视黄酸反应基因之一。随着高通量测序技术在生物研究中的大量应用，众多的miRNA被发现参与调控精子的发生过程。miRNA的调节机制主要是通过碱基互补配对原则与目标mRNA分子的3’端非编码区域(3-untranslated region，3’UTR)结合从而诱导目标mRNA降解或者抑制其翻译过程[2]。研究表明，miR-124a与Scp3作用，通过与粗线期精母细胞或精子细胞的H1t/GC-box 结合，进而激活 H1t 组蛋白启动子[3]；miR-29b[4]通过与Dnmt3a、Dnmt3b作用调控PGC向雌性生殖细胞分化；miR-18通过下调热休克蛋白2(HSP2)的表达而在小鼠精子发生过程中起到一定的调控作用[5]；miR-34c通过靶向Nanos2以促进小鼠鼠精原干细胞的分化[6]。众多研究结果提示，miRNA在雄性生殖细胞的分化中起关键性的调控作用。

在哺乳动物中，Stra8是生殖细胞由有丝分裂转变减数分裂前特异表达的基因[7-10]。研究表明，RA (retinoic acid) 可调控Stra8基因的表达，在RA的激活下生殖细胞表达Stra8促使细胞从有丝分裂进入减数分裂前期，产生有性生殖生物配子[11-13]；Mark等[12]在小鼠上对Stra8基因进行敲除后，发现敲除鼠除生殖功能发生变化外，其他表型均未发生变化；王丹[14]发现过表达Stra8能够促进鸡胚胎干细胞分化成精原干细胞；刘志永等[15]用Am80和TSA联合诱导下Stra8启动子启动活性增强。但是目前关于家禽Stra8基因的表达是否受到miRNA调控尚属未知。

本试验旨在利用3’RACE技术克隆如皋黄鸡Stra8基因的3’UTR序列，预测直接靶向Stra8基因的miRNA；采用双荧光素酶报告基因系统寻找活性最佳的miRNA，以期进一步研究miRNA介导调控的Stra8基因在家禽雄性生殖细胞分化中的作用，为揭示生殖细胞形成机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

如皋黄鸡来自中国农业科学院家禽研究所；DF-1细胞为本实验室保存；Trizol、大肠埃希菌DH5α感受态、胶回收试剂盒及小提质粒试剂盒均购自北京天根公司(北京)；双荧光素酶检测试剂盒 Dual-Luciferase®Reporter Assay System 购自Promega 公司(美国)；LipofectamineTM2000 购自 Invitrogen公司(美国)；Taqpolymerase购自NEB(美国)；琼脂糖购自Bio-Rad(美国)；T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer、DNA ladder、BamHⅠ、EcoRⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ、3’Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRtase购自TaKaRa(大连)；胎牛血清、DMEM、胰酶购自GIBICO(美国)；其余试剂均为进口或国产分析纯。PGL3-CMV-LUC-MCS载体、pGMLV-MA2载体、pRL-TK载体购自吉满生物，引物合成及测序由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2 克隆Stra8基因的3’UTR

通过NCBI提供的CDS序列(JX204292.1)，设计3’RACE 引物F1、F2(表1)。首先利用Trizol法提取精原干细胞总RNA，再使用TaKaRa 3’Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRtase 进行3’RACE试验获取Stra8基因的3’UTR。

1.3 生物信息学预测与鸡Stra8 基因3’UTR作用的miRNA

使用 Targetscan (http://www.targetscan.org/)在线生物软件预测在Stra8基因3’UTR处存在潜在靶标关系的鸡源miRNAs，选出可能性最大的4条miRNAs作为候选miRNA进行后续试验。

表1Stra8 3’RACE引物

Table 1 Primers ofStra8 3’RACE

引物名称Name引物序列Sequenceofprimer(5′→3′)Stra83’RACE⁃F1CTGGGTCCTACGGATGCTTGStra83’RACE⁃F2CGTTTGATGTTGCTGCTGGTT

1.4 报告基因载体及miRNA mimic构建

利用3’RACE得到的Stra8基因的3’UTR序列，加上XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点(表2)，克隆至 PGL3-CMV-LUC-MCS载体中，命名为PGL3-Stra8-3’UTR(野生型，简写为WT)。依据筛选的miRNA序列合成的引物(表2)，进行PCR扩增，克隆至pGMLV-MA2载体中命名为miR-1a、miR-1b、miR-31、miR-218。

靶基因双荧光素酶突变载体的构建主要是通过PCR的方法替换掉靶基因上的 miRNA结合位点。以PGL3-Stra8-3’UTR载体为模板，设计靶位点区突变引物(表2)，分别与Stra8基因3’UTR引物扩增，得到靶基因3’UTR序列结合位点上下游片段，以上下游片段混合物作为模板，PCR扩增无结合位点的靶基因3’UTR突变序列，然后通过连接至PGL3-CMV-LUC-MCS载体中，构建Stra8靶位点突变报告载体PGL3-Stra8-3’UTR-MT(简写为MT)。

1.5 细胞转染与双荧光素酶检测

DF-1细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，于37 ℃、5% CO2条件下培养。细胞瞬时转染按照LipofectamineTM2000转染操作说明书进行。转染前1 d接种24孔板，每孔细胞量约1×105个，培养过夜后对每孔细胞分别转染5组质粒，并设空白对照，具体试验分组：(1)miR-NC、PGL3-Stra8-3’UTR和 pRL-TK；(2)gga-miR-1a mimic、PGL3-Stra8-3’UTR和 pRL-TK；(3)gga-miR-1b mimic、PGL3-Stra8-3’UTR和pRL-TK；(4)gga-miR-31 mimic、PGL3-Stra8-3’UTR和pRL-TK；(5)gga-miR-218 mimic、PGL3-Stra8-3’UTR和pRL-TK。

转染完成后弃去细胞培养板中的培养液，按照双荧光素酶检测试剂盒说明，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性，计算每个转染3个平行样的相对发光比率(relative light unit，RLU)，并计算标准差，根据得到的比值来比较不同样品间报告基因的激活程度。同样的方法对点突变试验进行分组：(1) miR-NC、PGL3-Stra8-3’UTR和pRL-TK；(2) miR-31、PGL3-Stra8-3’UTR和pRL-TK；(3) miR-31、PGL3-Stra8-3’UTR-MT和pRL-TK。

1.6 统计学处理

所有数据以均数±标准误(Mean±SEM) 表示，应用GraphPad Prism 6.0统计学软件，采用两样本均数间t检验的方法，P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 鸡Stra8 基因3’UTR获取

以精原干细胞的cDNA为模板，根据NCBI数据库Stra8的CDS序列设计引物进行3’RACE扩增，克隆出大小约为500 bp和1 000 bp的条带(图1-A)，经连接T载体测序后得到包含多聚ploy A的Stra8的3’UTR序列(图1-B)。

表2 引物序列

Table 2 Sequence of primers

引物名称Name引物序列Sequenceofprimer(5′→3′)Stra8⁃3’UTR⁃F(XhoⅠ)CCGCTCGAG GTAGTTTCCCTGTTTGTCAATGTTTTGCStra8⁃3’UTR⁃R(XbaⅠ)GGCTCTAGA AATTTCAAGACACCATCTGAGCAGTACTACTCMT⁃F(XhoⅠ)CCGCTCGAG GTAGTTTCCCTGgTgtTaccTGgTggtaaAAGCATCACMT⁃R(XbaⅠ)CCGCTCTAGA AATTTCAAGACACCATCgga⁃miR⁃1a⁃F(XhoⅠ)CCGCTCGAG ACTGCCTCTTCCCAGCCCTAAgga⁃miR⁃1a⁃R(BamⅢ)CCGGGATCC ATGCCGCAGTCAGCATATTGAAgga⁃miR⁃1b⁃F(XhoⅠ)CCGCTCGAG ATTGGCTGCAGCTGAGTGCCgga⁃miR⁃1b⁃R(BamⅠ)CCGGGATCC TCCTGTCATCTCGTGTCACCTCGgga⁃miR⁃31⁃F(XhoⅠ)CCGCTCGAG AGCACAGAAGTCAAAACAGCCCTTTgga⁃miR⁃31⁃R(BamⅢ)CCGGGATCC AAGGGCTGGAAACAGCTCAGTGgga⁃miR⁃218⁃F(XhoⅠ)CCGCTCGAG GGTGGAGGAAACTTTCAATGTGGTTgga⁃miR⁃218⁃R(BamⅢ)CCGGGATCC GCAGCAAGAATAAATAGATCCTGAATGCC

标有下划线的为酶切位点。

The underlined expresses restriction site.

2.2 生物信息学预测鸡Stra8基因靶向miRNAs

本研究利用生物信息学在线软件Targetscan反向预测了鸡Stra8基因靶向的miRNAs。根据预测结果选择评分较高的4个miRNAs: gga-miR-1a、gga-miR-1b、gga-miR-31、gga-miR-218均与Stra8基因的3’UTR存在互补结合位点(表3)，因此以此4个miRNAs作为调控鸡Stra8基因的候选miRNA进行下一步筛选。

2.3 miRNA模拟物及鸡Stra8基因3’UTR双荧光素酶靶标载体与突变载体构建

经测序验证后，构建含有鸡Stra8基因3’UTR序列的PGL3-Stra8-3’UTR载体，利用XhoⅠ和XbaⅠ进行双酶切鉴定得到679 bp的3’UTR片段及5.4 kb PGL3的骨架载体(图2-A、D、E)。同样的方法验证构建好的Stra8基因的3’UTR双荧光素酶靶标突变载体(图2-C)。

gga-miR-1a、gga-miR-1b、gga-miR-31、gga-miR-218克隆至pGMLV-MA2载体中，分别构建其模拟物miR-1a、miR-1b、miR-31、miR-218，经测序显示克隆成功(图3)。

2.4 miRNA对鸡Stra8基因3’UTR的调控

重组载体PGL3-Stra8-3’UTR分别与4种gga-miRNA mimics转染DF-1细胞系，同时设置miR-NC为阴性对照，24 h后用双荧光素酶检测试剂盒检测，结果如图4-A所示。经t检验，miR-1a、miR-31、miR-218对鸡Stra8基因3’UTR抑制效果差异显著，其中miR-31+PGL3-Stra8-3’UTR共转染组的相对荧光素酶活性较miR-NC+PGL3-Stra8-3’UTR共转染组降低了32%(P<0.01)，miR-1a组降低了20.3%(P<0.01)，miR-218组降低了19.3%(P<0.01)；而PGL3-Stra8-3’UTR与miR-1b共转染时，其荧光比率较对照组没有显著差异(P>0.05)，说明gga-miR-1b对Stra8基因3’UTR无抑制作用。从最开始预测的4种miRNAs中初步筛选出3种miRNAs(gga-miR-1a、gga-miR-31、gga-miR-218)，可通过Stra8-3’UTR靶位点降低PGL3-Stra8-3’UTR的表达，其中gga-miR-31的抑制效果最佳。

A， 3’RACE扩增Stra8基因3’UTR；B， Stra8基因3’UTR序列A， Amplification of Stra8 3’UTR by 3’RACE；B， Sequence of Stra8 3’UTR图1 Stra8基因3’UTR克隆Fig.1 Cloning of Stra8 3’UTR

表3 与鸡Stra8基因3’UTR有互补结合位点的可能miRNAs

Table 3 Potential miRNAs targeting 3’UTR ofGallusStra8 gene

miRNAmiRNAmiRNA比对序列miRNA⁃align比对模式Alignment基因比对序列Gene⁃aligngga⁃miR⁃1a3’AUGUAUGAAGAAAUGUAAGGU5’|∶||||||：| ||：|||||5’TTTATACTTTTAAACGTTCCA3’gga⁃miR⁃1b3’AUGUAUGAAGAAUUGUAAGGU5’|∶||||||∶| ||∶|||||5’TTTATACTTTTAAACGTTCCA3’gga⁃miR⁃313’AUACGGUUGUAGAACGG5’|||∶|||∶∶|∶|||||5’TTTGTCAATGTTTTGCC3’gga⁃miR⁃2183’UGUACCAAUCUA⁃GUUCGUGUU5’∶|||| ||||||||∶||||5’GCTTGGAGAGATGCAAGTACAA3’

A，PGL3-CMV-LUC-MCS；B，miR-31靶向Stra8-3’UTR结合位点；C，PGL3-Stra8-3’UTR测序结果；D，PGL3-Stra8-3’UTR-MT测序结果；E，双酶切鉴定PGL3-Stra8-3’UTR及PGL3-Stra8-3’UTR-MT(1，WT；2，MT；M，DL5000 Marker)A， PGL3-CMV-LUC-MCS；B， Binding site of miR-31 to Stra8-3’UTR；C， Sequencing results of PGL3-Stra8-3’UTR；D， Sequencing results of PGL3-Stra8-3’UTR-MT ；E， Dual digestion of PGL3-Stra8-3’UTR and PGL3-Stra8-3’UTR-MT(1， WT；2， MT；M， DL5000 Marker)图2 PGL3-Stra8-3’UTR及PGL3-Stra8-3’UTR-MT构建Fig.2 Construction of PGL3-Stra8-3’UTR and PGL3-Stra8-3’UTR-MT

A， miR-1a；B， miR-1b；C， miR-31；D， miR-218图3 四个miRNA模拟物测序峰图Fig.3 Sequencing peak map of 4 miRNA mimics

为了进一步验证gga-miR-31与Stra8-3’UTR结合的靶位点，本试验将gga-miR-31与Stra8-3’UTR的靶位点进行了反义突变(图2-B)，设计构建针对gga-miR-31的Stra8-3’UTR突变载体并命名为PGL3-Stra8-3’UTR-MT(MT)(图2-C)。并将miR-31与PGL3-Stra8-3’UTR(WT)或PGL3-Stra8-3’UTR-MT(MT)共转染的双荧光素酶活性差异比较见图4-B。与miR-NC对照组相比，miR-31能显著下调PGL3-Stra8-3’UTR的荧光素酶活性，验证了miR-31能靶向结合鸡Stra8基因3’UTR，并对其表达进行调控。

3 讨论

在生物演变过程中，miRNA扮演着重要的角色，miRNA是一种大小约21～23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，成熟miRNA 引导 RISC 以碱基互补配对的方式与靶 mRNA 3’端非翻译区(3’UTR)进行完全配对或非完全配对结合，从而引起靶mRNA 的降解或抑制其翻译。因此本研究通过3’RACE技术克隆出鸡Stra8基因的3’UTR序列，利用Targetscan对靶向其3’UTR的miRNA进行了预测，发现存在靶向Stra8基因的miRNA，并筛选出能抑制Stra8表达的最佳miRNA。

Stra8基因是减数分裂的起始标志基因，研究表明，Stra8的表达不仅受到RA等一些小分子化合物的调控，还受到一些转录因子的调控，但是关于是否存在miRNA调控Stra8表达尚未有研究。本试验通过Stra8 3’UTR预测能靶向的miRNA，双荧光素酶检测结果显示，4个miRNA均能靶向Stra8，即初步说明存在参与雄性生殖分化的miRNA。现有研究表明，miRNA在哺乳动物的精子发生过程中扮演着重要的角色[16-20]。miR-544能直接下调 PLZF 的表达[21]，从而影响雄性生殖干细胞的自我更新与分化的平衡；miR-146 在精子发生分化过程中调节RA的影响[22]，从而调节减数分裂及精子形成；miR-122可能通过抑制TNP2的表达以及与精子发育相关蛋白的表达以影响精样细胞的生成[23]；PTEN可以负向调控PGCs的增殖，因此靶向PTEN基因的miR-19a和miR-19b可以通过调节PTEN的表达从而调控PGCs的生成[24]。这些均揭示了miRNA在生物发育过程中扮演着重要的角色，尤其是miRNA对基因的调控直接影响到雄性生殖细胞分化。

本试验筛选出miR-31靶向Stra8的活性最佳，因此初步判断，在生殖细胞发育过程中miR-31可通过影响Stra8基因的表达，从而调控减数分裂。目前关于miR-31的研究较少，且大部分是关于miR-31的研究与癌症相关：miR-31过表达会使人肺腺癌细胞周期阻滞在S期[25]；miR-31 通过抑制eNOS表达参与高糖诱导的内皮细胞功能障碍发生发展过程[26]；miR-31通过下调结直肠癌中抑癌基因FIH-1的表达从而增加转录因子HIF-1a的活性，最终间接上调HIF-1a所调控的下游肿瘤相关癌基因的表达[27]。miR-31在生殖细胞分化方面并没有过多的研究，因此本研究后续将对miR-31在生殖细胞分化上的功能进行进一步的研究。

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(责任编辑 张 韵)

Prediction and validation of miRNA targeting chickenStra8 gene

WANG Yingjie， ZUO Qisheng， ZHANG Liangliang， ZHANG Wenhui， JIN Jing， WANG Fei， JI Yanqin， JIN Kai， HE Nana， LI Bichun*， ZHANG Yani*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，KeyLaboratoryofAnimalBreedingReproductionandMolecularDesignforJiangsuProvince，Yangzhou225009，China)

This paper was aimed to clone 3’UTR ofStra8 gene of Rugao yellow chicken， and predicted the microRNAs (miRNA) targeting the gene to provide theoretical basis for further function study of Stra8 in the process of embryonic stem cells differentiation into the male germ cell mediated by miRNAs. 3′UTR ofStra8 was cloned by 3′RACE based on primers designed from cDNA ofGallusgallusin NCBI， then the vectors of Luciferase expression and mutation was constructed. Targetscan bioinformatics database was used to predict the prospective miRNAs targeting toStra8 and synthesize miRNA mimics. The candidate miRNA mimics and the vectors of Stra8-3’UTR were transiently co-transfected with into DF-1 cells， and pRL-TK vector was used as an internal control reporter. The dual-luciferase reporter assay system was used to evaluate the activity of luciferase. The results showed that 3′UTR ofStra8 was cloned. Four miRNAs has been predicted that targeting toStra8 by using the online bioinformatics database and their lentiviral vectors were constructed successfully. Dual luciferase activity test results showed that gga-miR-1a，gga-miR-31，gga-miR-218 can inhibit gene expression ofStra8， but inhibitor of gga-miR-31 was the best. The gga-miR-31 could significantly inhibit expression ofStra8， the results will provide references for the investigation onStra8 gene regulatory networks in male germ cell differentiation.

Gallusgallus; miRNA;Stra8; gga-miR-31; dual luciferase activity detection

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.07

2016-12-08

国家自然科学基金(31301959)；江苏省自然科学基金(BK20161331)；校大学生学术科技创新基金资助项目(x20160665)；江苏高校优势学科建设工程资助项目

王颖洁(1992—)，女，江苏镇江人，博士研究生，主要从事动物胚胎工程与遗传工程研究。E-mail: maggieyingjie@foxmail.com

*通信作者，张亚妮，E-mail: ynzhang@yzu.edu.cn；李碧春，E-mail: yubcli@yzu.edu.cn

S831.2

A

1004-1524(2017)05-0729-08

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 729-736

王颖洁，左其生，张良良，等. 靶向鸡Stra8基因的miRNA预测及鉴定[J].浙江农业学报，2017，29(5)： 729-736.