利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑水稻基因

原文霞，王栩鸣，李冬月，3，周 洁，严成其，*，陈剑平，*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华321004； 2.浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所，浙江省有害生物防控国家重点实验室培育基地，农业部植保生物技术重点实验室，浙江省植物病毒重点实验室，浙江 杭州310021； 3.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201)

利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑水稻基因

原文霞1，2，王栩鸣2，李冬月2，3，周 洁2，严成其1，2，*，陈剑平1，2，*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华321004； 2.浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所，浙江省有害生物防控国家重点实验室培育基地，农业部植保生物技术重点实验室，浙江省植物病毒重点实验室，浙江 杭州310021； 3.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201)

以现有水稻CRISPR/Cas9载体系统为起点，优化改造了相应的载体及其构建方法，实现了两步法构建基因敲除载体。利用新的载体和方法，针对水稻日本晴(OryzasativaL.spp.Japonicacv. Nipponbare)D3基因的3个靶向位点分别构建了相应的CRISPR/Cas9载体，并通过农杆菌介导的遗传转化成功获得一系列转基因植株。T0代转基因植株靶位点测序结果显示，靶位点DDRC1包括5种突变类型，植株的突变率为35.48%；靶位点DDRC2包括5种突变类型，植株的突变率为25.00%；靶位点DDRC3包括1种突变类型，植株的突变率为20.00%。利用T1代纯合突变植株，进一步研究了所得纯合突变体的株高、分蘖数表型与CRISPR/Cas9编辑后基因型之间的关系，探讨了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率、位置效应和突变类型等特点，为进一步利用CRISPR/Cas9系统发展具有不同农艺性状的水稻种质材料提供了参考。

水稻；CRISPR/Cas9；D3基因；基因编辑

对于植物基因功能特征和农作物的遗传改良研究来讲，基因编辑技术(genome editing)是一项具有非常诱人前景的技术[1]。为提高动植物基因编辑的效率，研究人员开发了人工核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)，EEN可以在DNA靶位点处产生DNA双链断裂(double strand breaks，DSBs)，它通过控制DNA的修复途径实现对基因组的定点编辑，DNA 损伤后产生的DSBs能够激活细胞内固有的修复机制非同源末端连接(non-homologous ending-joining，NHEJ)或同源重组(homologous recombination，HR)，该修复机制可以对损伤的DNA 进行修复[2]，从而实现对基因组的定点编辑。两种最常见的人工核酸内切酶是锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)，二者都成功地在多个物种上实现了打靶。无论是ZFN还是TALEN，都能够精确地调控靶基因的表达，但是，这些技术实验周期长，并且对实验室的技术有较高要求[3-4]。2013年初，出现了一种新型的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9系统，该系统主要依据细菌的一种获得性免疫系统改造而成[5]。CRISPR/Cas系统因其操作技术要求简单、专一性好、基因定点突变效率高，目前已经获得了广泛的研究，并被成功运用于如拟南芥、烟草、番茄、小麦和玉米等多种物种的基因编辑中[6-9]。

依据其结构特点，CRISPR/Cas系统可以分为3大类型(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型系统)。三者的共同特点是，由RNA介导的核酸酶可以特异性地切割外源入侵的DNA，包括噬菌体和质粒DNA[10]。其中，Ⅱ型CRISPR/Cas系统由于结构简单，目前被广泛应用于真核细胞的基因组编辑研究中。在该系统中，由单一的蛋白Cas9、crRNA、tracrRNA形成RNA-蛋白复合物，该复合物执行对外源DNA进行有效识别和切割特定位点的功能[11]。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(protospacer-adjacent motif，PAM)的5′-G-N19-NGG-3′特征区域的NGG位点，这种特征的序列在每128 bp的随机DNA序列中就重复出现一次[12]。

近几年，CRISPR/Cas9技术在水稻基因功能研究方面也有长足的发展，目前在全球范围内，CRISPR/Cas9技术在水稻中的运用主要聚焦于基因功能研究。虽然从技术上讲，采用CRISPR/Cas9技术编辑水稻基因组改变水稻各种农艺性状已不再具有不可逾越的障碍，但是目前对CRISPR/Cas9系统在水稻育种中的实用化研究还处于起步阶段，相关的研究也比较少。为实现从基础研究到生产应用的衔接，为水稻育种实践提供更直接的助力，充分了解CRISPR/Cas9基因编辑技术的特性显然已成为当前亟待解决的重要课题。本研究以现有CRISPR/Cas9载体系统[13]为起点，优化改造了CRISPR/Cas9载体的构建方法，并采用改造后的载体对水稻日本晴(OryzasativaL.spp.Japonicacv. Nipponbare)的D3基因[14-18]进行了基因编辑研究。通过分析所得突变体的株高、分蘖数表型与CRISPR/Cas9编辑后基因型之间的关系，探讨了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率、位置效应和突变类型等特点，为进一步利用CRISPR/Cas9系统发展具有不同农艺性状的水稻种质材料奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大肠埃希菌菌株(Escherichiacoli， DH5α)，根瘤农杆菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens， EHA105)，水稻品种日本晴(OryzasativaL. ssp.Japonicacv. Nipponbare)均由本实验室保存。本研究中所用的pOsU6-SK和p35s-Cas9-SK基础载体由美国加州大学朱健康教授提供。双元载体骨架为pCAMBIA1300，由澳大利亚CAMBIA实验室惠赠。其他市售试剂包括Klenow fragment (NEB，Beverly，MA)、Phusion DNA polymerase (NEB，Beverly，MA)、TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)、质粒提取试剂盒(Promega，Madison，USA)、ccdBr2感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。研究所用其他限制性内切酶均采用NEB(北京)公司产品。研究中所用引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，相关测序工作由铂尚生物技术(杭州)有限公司完成。

1.2 实验方法

1.2.1 大肠埃希菌感受态的制备与转化

本研究所用大肠埃希菌DH5α热击感受态细胞的制备，转化均按Innova法操作[19]。

1.2.2 农杆菌感受态的制备

本研究所用农杆菌感受态细胞由实验室自行制备，步骤如下：取25 μL农杆菌菌液接种于5 mL YEP/Str+液体培养基中(含链霉素50 μg·mL-1)，28 ℃，230 r·min-1培养过夜；取1 mL新鲜菌液接种至200 mL YEP/Str+液体培养基中，28 ℃，230 r·min-1培养至D600≈0.6；然后于4 ℃ 4 000 r·min-1条件下离心10 min；弃去上清，沉淀采用20 mL新鲜配制并经冰浴的HEPES(1 mmol·L-1，pH 7.0)重悬；重复以上离心重悬清洗步骤2～3次后，用8 mL冰浴的10%甘油重悬；最后将其分装到1.5 mL离心管中，每管分装100 μL，置于液氮中速冻，-80 ℃冻存备用。

1.2.3 CRISPR/Cas9载体优化

为了提高载体构建效率，实现两步法构建CRISPR/Cas9载体，我们对朱健康教授实验室提供的载体进行了优化。首先以pX2E载体(基于Gateway技术的低成本植物双分子荧光互补分析系统)为模板，采用FastCas-F1、FastCas-R1扩增了包含氯霉素抗性基因和ccdB自杀基因的片段；然后，以此PCR产物为模板，再用FastCas-F2、FastCas-R2扩增引入了BaeⅠ酶切位点。在片段扩增的同时，我们采用BbsⅠ内切酶对pOsU6-SK载体进行酶切，并用Klenow fragment对酶切后的产物进行补平，获得的线性化平末端载体与包含氯霉素抗性基因和ccdB自杀基因片段的PCR产物相连接。此后，按文献[13]步骤，采用KpnⅠ-Hind Ⅲ对获得的质粒进行酶切，得到的产物与Hind Ⅲ-EcoR Ⅰ酶切的p35-Cas9-SK载体及KpnⅠ-EcoRⅠ双酶切后的pCAMBIA1300载体进行三片段连接。连接产物采用热击转化的方法转入ccdBr2感受态细胞，转化流程按Invitrogen公司手册进行。整体改造流程如图1-A所示，相关引物见表1，最终获得CRISPR/Cas9载体命名为pOsFastCas9，其T-DNA边界内功能区结构如图1-B所示。

1.2.4 靶位点选择及引物设计

从网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上获得水稻日本晴D3(Os06g0154200)基因序列，并在序列中寻找Cas9潜在靶向位点，即符合5′-GN19NGG-3′的序列，根据靶位点的位置及GC含量，筛选D3基因序列12、1 445、2 068 bp处的NGG前20 bp作为3个靶向序列，分别命名为DDRC1、DDRC2、DDRC3。以筛选到的靶向核苷酸序列5′-GN19NGG-3′中NGG前的20 bp为基础，按照5′-GN19GTTTT-3′，3′-ACACACN19-5′的模板编辑正向和反向引物，使引物经退火后能够形成如图2所示的结构，具体引物信息如表2。

1.2.5 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

靶序列正反向引物经退火(95 ℃，3 min；22 ℃，1 min，降温速率，0.1 ℃·s-1；22 ℃，∞)生成接头；将接头产物与CRISPR/Cas9基因编辑载体BaeⅠ酶切产物用T4连接酶置于25 ℃反应2 h，获得相应CRISPR/Cas9表达载体。取5 μL连接产物，转化到大肠埃希菌热激感受态DH5α中，涂布于LB/K+平板上(含卡那霉素50 μg·mL-1)，37 ℃培养箱倒置培养过夜，挑取克隆培养6～12 h，用载体上的通用引物M13-F与靶序列的下游引物DDRCN-R进行菌液PCR鉴定，阳性鉴定正确后，将菌液送铂尚生物技术(杭州)有限公司测序(引物信息见表2)。

1.2.6 农杆菌的转化及其介导的水稻日本晴遗传转化

将构建得到的CRISPR/Cas9表达载体的质粒DNA通过电击转入农杆菌菌株EHA105中。电击转化时将感受态细胞于冰上解冻，将2 μL纯化过的质粒DNA加入感受态细胞，混匀后加入到预冷的电击杯中，并采用Eppendorf Eporator电转仪在12 500 V·cm-1电场电击；电击后迅速加入800 μL无抗生素的YEP培养液，并转移至1.5 mL离心管中于28 ℃ 230 r·min-1振荡培养；2 h后取100 μL菌液，涂布于YEP/K+平板上(含卡那霉素50 μg·mL-1)，28 ℃培养箱倒置培养24～48 h。挑取克隆培养6～12 h，用载体上的通用引物M13-F与靶序列的下游引物DDRCN-R进行菌液PCR鉴定，阳性鉴定正确后，再将农杆菌转入日本晴的愈伤组织中，经遗传转化获得相应的转基因植株。

A，p35-Cas9-SK导入含氯霉素抗性基因和ccdB致死基因片段流程图。Cm(R)，氯霉素抗性基因；ccdB，ccdB致死基因；BbsI，BbsI内切酶；Klenow，DNA聚合酶Klenow片段；Ligation，T4 DNA连接酶介导的连接反应；BaeI，BaeI内切酶识别位点；FastCas-F1、FastCas-R1、FastCas-F2和FastCas-R2，扩增用的引物；B，pOsFastCas9载体T-DNA边界内功能区结构。 T-Border(R) 和T-Border(L)，T-DNA边界；OsU6-2 Promoter，水稻U6启动子；BaeI Cuts，BaeI内切酶识别位点；Cm(R)，氯霉素抗性基因；ccdB，ccdB致死基因；Terminator T，终止子；gRNA，向导RNA序列；2×35S，2×35S启动子；3×Flag，3×Flag标签；NLS，核定位信号；Cas9，Cas9酶；NOS，NOS终止子；35S Promoter，35S启动子；Hygromycin(R)，潮霉素抗性基因；35S PolyA，35S polyA终止子A， Flowchart of p35-Cas9-SK inserted chloramphenicol resistance genes and the lethal gene ccdB; Cm(R), the resistance genes of chloramphenicol; ccdB， the lethal gene ccdB; BbsⅠ， the restriction enzymes of BbsⅠ; Klenow， DNA polymerase Klenow fragment; Ligation， the ligase chain reaction mediated by T4 DNA ligase; BaeⅠ， the recognition site of BaeⅠ; FastCas-F1， FastCas-R1， FastCas-F2 and FastCas-R2， the primers for amplificationB， Structure of T-DNA of pOsFastCas9vector between T-borders. T-Border(R) and T-Border(L)， the border of T-DNA; OsU6-2 Promoter， the U6 promoter of rice; BaeⅠ Cuts， the restriction enzymes of BaeⅠ; Cm(R)， the resistance genes of chloramphenicol; ccdB， the lethal gene of ccdB; Terminator T， the terminator; gRNA， the sequence of guide RNA; 2×35S， 2×35S promoter; 3×Flag， 3×Flag label; NLS， nuclear localization signal; Cas9， the enzyme of Cas9; NOS， the terminator of NOS; 35S Promoter， the promoter of 35S; Hygromycin(R)， the resistance genes of Hygromycin; 35S PolyA， the terminator of 35S polyA图1 pOsFastCas9载体改造流程示意图Fig.1 Schematic diagram of pOsFastCas9 construction workflow

表1 pOsFastCas9载体改造引物序列

Table 1 Nucleotide sequence of pOsFastCas9 vector transformation primer

名称Name引物核苷酸序列Nucleotidesequenceofprimers(5′→3′)FastCas⁃F1TTGGCAGCATCACCCGAFastCas⁃R1GCTGTGTATAAGGGAGFastCas⁃F2GAGGCAGCAGACACAGGTATCGCGATAGACGGGTAAGTTGGCAGCATCACFastCas⁃R2TGATAAGGAGACGGCCGTACCGTTGACCTGCAGACTGGCTGTGTATAAGG

图2 粘性接头结构图Fig.2 Schematic diagram of linker

表2 靶向位点及对应引物核苷酸序列

Table 2 Nucleotide sequence of target site and the corresponding primer

名称Name核苷酸序列Nucleotidesequence(5′→3′)DDRC1GGAGTAGACGTCGCCCATGGCGGDDRC2GTGCCATTTGCAACACTGCAGGGDDRC3GCGGGACATGCAGTTGCGGGAGGDDRC1⁃FGGAGTAGACGTCGCCCATGGGTTTTDDRC1⁃RCCATGGGCGACGTCTACTCCACACADDRC2⁃FGTGCCATTTGCAACACTGCAGTTTTDDRC2⁃RTGCAGTGTTGCAAATGGCACACACADDRC3⁃FGCGGGACATGCAGTTGCGGGGTTTTDDRC3⁃RCCCGCAACTGCATGTCCCGCACACAM13⁃FCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC

“ ”表示PAM位点。

The underlined represents PAM site.

1.2.7 转基因水稻植株突变体检测

在靶序列上下游200 bp左右处设计正向引物与反向引物，作为鉴定是否发生突变的特异性引物，用于扩增包含靶序列在内的目的片段(引物具体信息如表3)。以粗提转基因植株的总DNA为模板，用相应的特异性引物PCR扩增目的片段，将扩增产物送到铂尚生物技术(杭州)有限公司进行测序，最终通过序列比对鉴定获得的突变植株。

表3 测序引物核苷酸序列

Table 3 Nucleotide sequence of sequencing primer

名称Name引物核苷酸序列Nucleotidesequenceofprimers(5′→3′)DDRC1⁃Seq⁃FAAGGGAGAGCTGTCGAGTATATCACDDRC1⁃Seq⁃RACCTCACGTCCGTCAGGAAGCTCAGDDRC2⁃Seq⁃FCCTACTCTCAAGGAAGTCACTGTCTDDRC2⁃Seq⁃RACCATAGGGAGAGTGACCTGAGCATDDRC3⁃Seq⁃FACTTTGTATGAATTGGACTACTGGCDDRC3⁃Seq⁃RTTTTGTGCCCACATAACTAATCATC

2 结果与分析

2.1 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

D3基因在根、叶片和花中显著表达，并参与调控叶片衰老和细胞死亡过程，现有的研究显示，其突变会导致分蘖增多，株高矮化等表型[14-18]。为分析CRISPR/Cas9基因编辑系统对基因功能的影响，我们选择在该基因CDS的不同位置进行基因编辑。如图3所示，D3基因包括4个外显子，其CDS序列位于第1个外显子上。筛选设计的三个靶位点均位于D3基因的CDS序列上，DDRC1位于CDS序列的12 bp处，DDRC2位于CDS序列1 445 bp处，DDRC3位于CDS序列的2 068 bp处。正向引物与反向引物通过退火生成粘性接头，并与BaeⅠ酶切的线性CRISPR/Cas9基因编辑载体连接，测序结果表明D3基因的三个靶向序列DDRC1、DDRC2、DDRC3的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建成功。

DDRC1、DDRC2、DDRC3为D3基因CDS序列上筛选设计的三个CRISPR/Cas9基因编辑载体作用的靶位点DDRC1， DDRC2， DDRC3: three CRISPR/Cas9 target sites in the CDS of D3 gene图3 水稻D3基因结构及CRISPR/Cas9靶位点示意图Fig.3 Schematic diagram of D3 gene structure and CRISPR/Cas9 target site

2.2 优化的CRISPR/Cas9载体能有效编辑水稻基因组

为了验证构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体能否有效对预设靶位点进行编辑，我们对野生型日本晴植株和转基因T0代植株的基因靶序列进行了测序分析。测序结果显示，T0代植株中检测到了预期的突变。为精确分析突变类型，我们繁育了T1代转基因材料。结合T0和T1代材料的测序数据，得出如下结果，DDRC1经遗传转化得到31株转基因植株，经测序鉴定有11株植株的靶序列发生突变，突变率为35.48%，包括5种突变类型，突变方式Mutant1为缺失2个碱基(AT)，突变方式Mutant2为缺失1个碱基(A)，突变方式Mutant3为插入1个碱基(T)，突变方式Mutant4为插入1个碱基(G)，突变方式Mutant5为插入1个碱基(A)；DDRC2经遗传转化得到24株转基因植株，经测序鉴定有6株植株的靶序列发生突变，突变率为25.00%，包括5种突变类型，突变方式Mutant1为缺失3个碱基(TTG)，突变方式Mutant2为缺失3个碱基(AGT)，突变方式Mutant3为缺失2个碱基(GT)，突变方式Mutant4为缺失2个碱基(TG)，突变方式Mutant5为缺失4个碱基(GTGT)；DDRC3经遗传转化得到10株转基因植株，经测序鉴定有2株植株的靶序列发生突变，突变率为20.00%，包括1种突变类型，突变方式Mutant1为缺失8个碱基(CAGTTGCG)；总突变率为29.23%，共产生11种突变。具体突变方式如图4所示。

在检测突变类型的同时，我们还对CRISPR/Cas9基因编辑载体作用后产生的突变的遗传特性进行了分析，经过对部分突变植株的T1代靶向序列进行分析，发现了纯合突变植株，这说明变异可以稳定地遗传到子代中。DDRC1中选取1种缺失突变(突变方式Mutant1)，命名为株系a；选取1种插入突变(突变方式Mutant3)，命名为株系b；DDRC2中选取1种缺失突变(突变方式Mutant2)，命名为株系c；DDRC3中选取1种缺失突变(突变方式Mutant1)，命名为株系d。这4个株系扩繁后，分别对各自得到的10株T1代植株进行突变检测，结果显示，株系a的10株T1代植株中有2株为纯合突变，命名为a1、a2；株系b的10株T1植株中有1株为纯合突变，命名为b1；株系c的10株T1植株中有1株为纯合突变，命名为c1；株系d的10株T1植株中有2株为纯合突变，命名为d1、d2；并且，T1代植株的突变方式与相对应的T0代突变方式相同，具体测序比对结果如图5。

“ ”表示PAM位点，“-”表示碱基缺失突变，“+”表示碱基插入突变；A，DDRC1 T0代31株植株中有11株发生突变，包括5种突变类型。WT为靶向的野生型水稻D3的基因序列；Mutant1为缺失2个碱基(AT)；Mutant2为缺失一个碱基(A)；Mutant3为插入1个碱基(T)；Mutant4为插入1个碱基(G)；Mutant5为插入1个碱基(A)。B，DDRC2 T0代24株植株中有6株发生突变，包括5种突变类型。WT为靶向的野生型水稻D3的基因序列；Mutant1为缺失3个碱基(TTG)；Mutant2为缺失3个碱基(AGT)；Mutant3为缺失2个碱基(GT)；Mutant4为缺失2个碱基(TG)；Mutant5为缺失4个碱基(GTGT)。C，DDRC3 T0代10株植株中有2株发生突变，包括1种突变类型。WT为靶向的野生型水稻D3的基因序列；Mutant1为缺失8个碱基(CAGTTGCG)“_”， PAM site; “-”， base deletion ; “+”， base insertion; A， 11 mutations were identified in 31 transgenic plants of DDRC1， including 5 mutation type; WT, the sequence of D3 in wild rice; Mutant1, 2 bases deleted (AT); Mutant2, 1 base deleted (A); Mutant3, 1 base inserted (T); Mutant4, 1 base inserted (G); Mutant5, 1 base inserted (A). B， 6 mutations were identified in 24 transgenic plants of DDRC2， including 4 mutation type; WT, the sequence of D3 in wild rice; Mutant1, 3 bases deleted (TTG); Mutant2, 3 bases deleted (AGT); Mutant3, 2 bases deleted (GT); Mutant4, 2 bases deleted (TG); Mutant5, 4 bases deleted (GTGT). C， Two mutations were identified in 10 transgenic plants of DDRC3， including 1 mutation type; WT, the sequence of D3 in wild rice; Mutant1, 8 bases(CAGTTGCG) deleted图4 T0代转基因植株具体突变类型Fig.4 The mutation type of T0 transgenic lines

A为株系a，DDRC1(Mutant1)纯合突变植株a1和a2的测序结果；B为株系b，DDRC1(Mutant3)纯合突变植株b1的测序结果；C为株系c，DDRC2(Mutant2)纯合突变植株c1的测序结果；D为株系d，DDRC3(Mutant1)纯合突变植株d1和d2的测序结果A， the sequencing result of the homozygous mutant plants a1and a2 of the DDRC1(Mutant1); B， the sequencing result of the homozygous mutant plant b1 of DDRC1(Mutant3); C， the sequencing result of the homozygous mutant plant c1 of DDRC2(Mutant2); D， the sequencing result of the homozygous mutant plants d1and d2 of DDRC3(Mutant1)图5 T1代转基因植株的测序结果Fig.5 The sequencing results of T1 transgenic lines

2.3 转基因水稻突变体植株表型鉴定

如表4与图6所示，3周龄T1代纯合突变植株中，a1和a2对应的靶位点为DDRC1，突变方式为缺失2个碱基(AT)，与野生型日本晴相比，株高及分蘖数没有明显变化；b1对应的靶位点为DDRC1，突变方式为插入一个碱基(T)，与野生型日本晴相比，也无明显的表型差异；c1对应的靶位点为DDRC2，突变方式为缺失3个碱基(AGT)，与野生型日本晴相比，也无明显的表型差异；d1和d2对应的靶位点为DDRC3，突变方式为缺失8个碱基(CAGTTGCG)，与野生型日本晴相比，株高明显变矮，分蘖数增多。3周龄T1代纯合突变植株中，只有靶向位点DDRC3的纯合突变植株表型有明显变化，靶向位点DDRC1 与DDRC2的纯合突变植株表型没有明显变化，推测其可能与靶位点的位置及其突变方式有关系。T1代纯合突变植株a1、a2、b1的缺失或者插入突变破坏了CDS序列的起始密码子ATG，但在序列分析中我们发现，靶位点DDRC1下游135 bp处有还存在一个ATG序列，这个ATG序列可能替代上游的ATG位点重新起始了基因的表达。由于新的表达框只导致基因5’部分缺失，很可能对基因功能只产生了较小的影响，因而没有产生明显的表型变化。而T1代纯合突变植株c1缺失的3个碱基(AGT)位于D3基因CDS序列的1 441～1 443 bp处，引起了一个三联密码子的缺失，对应的氨基酸残基缺失很可能不能显著影响基因的功能，因此突变体的表型也没有受到明显的影响。DDRC3位点上的突变体d1和d2产生明显的形态变化，则表明较长的片段缺失能够更有效地改变基因功能，从而影响植物的表型。这些发现，提示我们在对单个基因功能进行研究时，如果仅产生一种类型的突变，有可能无法确定基因的功能，需要通过获得多种类型的突变，来相互印证以确保基因功能分析的准确性。而在突变类型的选择上，要尽可能避免选择少量缺失或变化较小的突变类型。

表4 T1代纯合突变植株的突变方式及其表型对应表

Table 4 The corresponding table of genotype and phenotype of T1homozygous mutants

纯合突变植株名称Homozygousmutantplantsname靶点位置Targetposition突变方式Mutationpattern与野生型日本晴相比株高变化Heightchangecomparedwithwildtype与野生型日本晴相比分蘖数变化Tillernumberchangecomparedwithwildtypea1DDRC1缺失两个碱基Twobasesdeleted(AT)无明显变化Nosignificantchange无变化Nochangea2DDRC1缺失两个碱基Twobasesdeleted(AT)无明显变化Nosignificantchange无变化Nochangeb1DDRC1插入一个碱基onebaseinserted(T)无明显变化Nosignificantchange无变化Nochangec1DDRC2缺失三个碱基Threebasesdeleted(AGT)无明显变化Nosignificantchange无变化Nochanged1DDRC3缺失八个碱基Eightbasesdeleted(CAGTTGCG)较矮Shorter增多Increasedd2DDRC3缺失八个碱基Eightbasesdeleted(CAGTTGCG)较矮Shorter增多Increased

A、B、C和D中的植株a1、a2、b1、c1与野生型日本晴wt相比，表型没有明显变化；E和F中的植株d1、d2与野生型日本晴wt相比，表型变化明显，株高变矮，分蘖数增多A， B， C and D， the phenotype of the plant (a1， a2， b1 and c1) did not change significantly compared with wild type; E and F， the phenotype of the plant (d1 and d2) changed significantly compared with wild type， the plant height became shorter， and the tiller number became more图6 T1代转基因植株的表型Fig.6 The phenotype of T1 transgenic plants

3 讨论

水稻新品种培育的基础在于现有优质种质资源，而其成功的关键在于准确选择合适的基因进行改造。植物生长发育、抵御不良环境和抗病防卫反应中同时存在着正向和负向调控基因，因此可以考虑通过导入正向调控基因或敲除负向调控基因来实现水稻抗病性的提升。根据目前的技术水平，CRISPR/Cas9在水稻中的基因敲除效率比基于该技术的基因敲入/替换效率要高得多[20]。因此，选择水稻特定的调控基因进行定点敲除，显然是目前最为简洁有效的策略。

本研究结果表明，CRISPR/Cas9基因编辑技术能以较高效率成功编辑水稻靶向DNA 序列，同时靶向编辑效率受靶向位置影响。并且，同一靶向位点，可以产生多种突变方式，靶位点PAM前发生碱基缺失或者插入，发生碱基缺失占总突变的比例为72.23%。此外，我们还发现CRISPR/Cas9基因编辑载体靶向的基因序列的位置的不同，导致纯合突变体植株呈现出的表型也不尽相同。由以上结果可见，基于CRISPR/Cas9基因编辑技术发展的遗传材料往往存在不同的突变方式，能为进一步研究提供丰富的遗传材料。值得注意的是，CRISPR/Cas9获得的材料中有部分有明确的基因型突变，但是却无明显的表型差异。这一现象提示我们利用CRISPR/Cas9技术，不仅能发展基因功能研究的基础材料，同时也具有重大的应用价值。以水稻抗病育种为例，水稻基因组中存在大量抗病负调控基因，如pi21、OsWAK112d、Ob-fold等基因[21-24]均为稻瘟病的负向调控基因，根据现有的研究结果，定向地编辑这些基因，使得这些基因功能缺失或改变将有助于水稻抗病性的提升。此外，从我们的研究可以看出，针对同一基因，不仅不同位点的编辑会产生不同的效果，即便是同一位点的编辑也能产生不同的突变类型。因此，基于现有的优良种质针对这些靶位点进行改造，显然能够帮助我们以相当高的效率衍生出一系列综合性状优良，同时兼具不同特性的新种质，从而加快水稻抗病育种进程。

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(责任编辑 张 韵)

Application of the technology of CRISPR/Cas9 edit rice gene

YUAN Wenxia1，2， WANG Xuming2， LI Dongyue2，3， ZHOU Jie2， YAN Chengqi1，2，*， CHEN Jianping1，2，*

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences，ZhejiangNormalUniversity，Jinhua321004，China；2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl，MOAKeyLaboratoryforPlantProtectionandBiotechnology，ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofVirology，InstituteofVirologyandBiotechnology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 3.CollegeofPlantProtection，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China)

In this study， the CRISPR/Cas9 vector system was optimized in order to construct gene editing constructors in two steps. With optimized CRISPR/Cas9 system， three genome editing constructors targeting different sites ofD3 gene in rice (OryzasativaL. spp.Japonicacv. Nipponbare) were generated， and the transgenic plants were successfully produced byAgrobacterium-mediated transformation. The sequencing results of T0transgenic plants showed that the mutation rate of target site DDRC1 was 35.48%， and five mutation types were detected; the mutation rate of target site DDRC2 was 25.00%， and also with five mutation types; the mutation rate of target site DDRC3 was 20.00%， and only one mutation type was detected. The phenotype， height and tiller number， together with the genotypes of homozygous mutants were investigated， and the gene editing efficiency of the optimized CRISPR/Cas9 system along with the position effect and mutation patterns were also analyzed and discussed. In summary， the findings in this research provided important information for further developing and utilizing of rice germplasm on variety agronomic trait with the optimized CRISPR/Cas9 system.

rice; CRISPR/Cas9;D3 gene; gene editing

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.01

2017-03-09

国家重点研发计划(2016YFD0100601，2016YFD0200804)；浙江省自然基金(2014C140001，2016C110017)

原文霞(1990—)，女，山西汾阳人，硕士研究生，主要从事植物病理学研究。E-mail: yuanwenxia5@163.com

*通信作者，严成其，E-mail: yanchengqi@163.com；陈剑平，E-mail: jpchen2001@126.com

S511；Q789

A

1004-1524(2017)05-0685-09

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 685-693

原文霞，王栩鸣，李冬月，等. 利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑水稻基因[J].浙江农业学报，2017，29(5)： 685-693.