原花青素B2保护血管内皮细胞延缓凋亡及机制研究

李 强，杨成明

(1.重庆市南川区人民医院心内科 408400；2.第三军医大学野战外科研究所大坪医院心内科 400042)

论著·基础研究

原花青素B2保护血管内皮细胞延缓凋亡及机制研究

李 强1，杨成明2△

(1.重庆市南川区人民医院心内科 408400；2.第三军医大学野战外科研究所大坪医院心内科 400042)

目的 以H2O2诱导人内皮细胞凋亡为模型，观察原花青素B2(GSPB2)延缓人内皮细胞凋亡的保护作用及其机制。方法 用0.5 mmol H2O2预处理细胞，分别加入不同浓度的GSPB2(5.0、10.0、20.0 μmol/L)保护细胞，TUNEL法检测细胞凋亡；Western blotting检测凋亡相关分子Caspase-3、Bax、Bcl-2以及影响凋亡的相关分子PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表达；Transwell小室检测各组细胞迁移情况。结果 0.5 mmol H2O2致人内皮细胞凋亡明显增加(P<0.01)，GSPB2能明显减轻H2O2所致的人内皮细胞凋亡(P<0.05)，10 μmol/mL的GSPB2就能接近恢复到H2O2未处理的对照组水平。进一步研究发现：Caspase-3、bax蛋白表达上调，Bcl-2表达下调；PI3K、p-Akt、Akt表达上调。结论 不同浓度的GSPB2对H2O2诱导的血管内皮细胞具有保护作用，而且表现为浓度依赖性和时间依赖性，其机制与相关分子PI3K、p-Akt、Akt有关。

原花青素B2；凋亡；血管内皮细胞

心血管疾病的发病率和病死率在所有疾病中是最高的，血管内皮细胞分布广，极易受到多种因素的影响，其中，氧化与抗氧化对弈、凋亡与抗凋亡的矛盾，都发生在血管内皮细胞，进而与心血管疾病相关联。原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSPs)广泛存在于水果、蔬菜、花、坚果、种子和树皮中，是一类多羟基黄烷-3-酚的低聚物，也有以高聚物形式存在的酚类化合物，原花青素与缩合单宁是同系物，是多羟基黄烷-3-酚的寡聚或高聚物，大多以C4→C8键相互连接，也存在C4→C6键连接[1]。具有抗氧化、清除自由基、心血管保护、抗炎、抗血小板聚集、抗肿瘤、调节血脂、抗高血压、抑制细胞增殖、调节免疫、保护肝脏、抑制细胞凋亡以及抗疲劳、改善睡眠等广泛的生物活性,且具有高效、低毒、生物利用度高等特点[2-5]。研究发现：Bax/Bcl-2蛋白和半胱天冬酶-3活化与GSP处理诱导的凋亡现象间有所关联[6]。因此，探讨原花青素对血管内皮细胞的保护机制具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 原花青素B2(GSPB2)(货号B10957)，标准品大于或等于98%，购自上海士锋生物科技有限公司；H2O2DMSO购自Sigma公司，小鼠抗人caspase-3、 抗人BCL-2 、抗人bax、抗人akt、抗人 p-akt、抗人PI3K单抗均购自Cell Signaling Technology公司。Tulne试剂盒购自罗氏公司，一次性细胞培养瓶(25 cm2、75 cm2)细胞培养板等购自Coster公司。CO2细胞培养箱购自Shellab公司；倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；电子天平(Thermo Scientific)、酶标仪、电泳仪购自Bio-Rad公司；纯水制备系统购自Millipore公司；pH计购自上海大普仪器有限公司；光学显微镜及其成像系统购自Bio-Rad公司；摇床、组化笔、小型染色缸、湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的移液器及枪头等。

1.2 主要溶液配制方法 (1)GSPB2溶液：用DMSO直接溶解粉状的GSPB2至终浓度为40 mmd/L，-20 ℃保存备用。(2)10%FBS的DMEM/H细胞完全培养基：于500 mL装的DMEM/H培养液中加入青霉素与链霉素使其终浓度都为100 U/mL，于4 ℃保存。使用前与胎牛血清以9∶1的比例混合，4 ℃保存待用。(3)PBS溶液：将PBS缓冲体系(粉末)充分溶于超纯水，配制成1×PBS缓冲液，分装后高温高压灭菌。(4)0.25%胰酶：称取0.25 g胰蛋白酶和0.02 g乙二胺四乙酸(EDTA)，溶解于100 mL PBS缓冲液中，充分搅拌混匀，4 ℃放置过夜后于超净工作台用一次性过滤器过滤除菌，4 ℃保存。

1.3 细胞培养及分组 人脐静脉血管内皮细胞株CRL-2932细胞购自ATCC公司。用含有10%胎牛血清的DMEM/H的完全培养基，在37 ℃、5%CO2且湿度饱和的恒温细胞培养箱中培养。显微镜下观察细胞贴壁生长至80%～95%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。

1.3.1 分组 (1)空白对照组,换无血清DMEM/H继续培养；(2)H2O2组，换无血清DMEM/H培养基2 h后，加入终浓度为1 mmol/L的H2O2培养24 h。(3)GSPB2+H2O2组，换无血清培养基，不同浓度的GSPS(5.0、10.0、20.0 μmol/L)预处理2 h后加H2O2孵育24 h。但是免疫印迹选用的时间为24 h，GSPB2的浓度为10.0 μmol/L。

1.3.2 CCK-8 法检测细胞的存活率 取对数生长期的细胞，接种于96孔板(每孔接2 000个细胞)，在37℃、5%CO2培养条件培养过夜，按分组要求给予不同因素的处理，每组设8个平行孔，培养24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8，继续培养2 h，用分光光度计在540 nm出读取光度值(OD)，取其8孔的平均值按公司计算细胞的存活率，细胞的存活率(%)=处理组OD/对照组×100%。

1.3.3 TUNEL检测细胞的凋亡取对数生长的细胞，消化成为细胞悬液，1×105个细胞/每孔接种于24孔板中，24孔板内放入细胞爬片，在37 ℃、5%CO2培养条件培养过夜，按分组要求给予不同因素的处理，培养24 h后。PBS洗3次-4%多聚甲醛固定-PBS洗3次-0.3%triton-100透化细胞-PBS洗3次-滴加TUNEL反应物，37 ℃孵育60 min-冲洗样品5～20 min-用抗荧光碎灭封片剂封片，荧光显微镜拍照分析结果。

1.4 免疫印迹检测Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达 提取各组CRL-2932细胞的总蛋白，用BCA法测定各组细胞蛋白的含量，每孔上样25 μg的总蛋白，用5%积层胶和10%的分离胶电泳后，半干转法将蛋白转移到PVDF膜上，室温用TBST配制的5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入人抗的总Caspase-3(1∶500稀释)，活化的Caspase-3(1∶500稀释)，人抗的Bax(1∶1 000稀释)，人抗的PI3K(1∶1 000稀释)，人抗的p-Akt(1∶1 000稀释) 人抗的Akt(1∶1 000稀释)，4℃过夜孵育，复温半小时，TBST洗3次，每次10 min，加入HRP标记的兔抗人的二抗(1∶2 000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，化学发光显影目的条带和内参，用Quantity Qne软件分析光密度值，代表蛋白表达的相对含量。

2 结 果

2.1 细胞存活率 用H2O2孵育内皮细胞24 h后，明显下降(P<0.05)，细胞的存活率仅为对照组的59.1%±1.2%。用不同浓度的GSPB2和H2O2共同孵育内皮细胞后，细胞的存活率依次分别为：64.5%±1.8%，80.5 %±2.2%，85.4 %±1.9%。随着GSPB2浓度增高，内皮细胞的存活率增加，成浓度依赖性，但10.0 μmol/L和20.0 μmol/L之间对细胞的活性差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 10.0 μmol/L GSPB2对H2O2诱导内皮细胞的凋亡保护作用

A:对照组；b：H2O2(0.5 mmol/L)；c：H2O2(0.5 mmol/L)+GSPB2(10 μmol/L)。

图2 10 μmol/L GSPB2对内皮细胞的保护作用

2.2 GSPB2对H2O2诱导内皮细胞凋亡的影响 采用TUNEL染色检测内皮细胞的凋亡，观察GSPB2(浓度10.0 μmol/L)保护H2O2诱导的内皮细胞发生凋亡情况。结果发现：正常情况下细胞凋亡率为1.0%，存活率为99.0%，在浓度为1.0 mml/L的H2O2孵育24 h后，细胞的凋亡率明显增加，为41.0%，存活率为59.0%。用浓度为10.0 μmol/L的GSPS预处理2 h后，再加H2O2孵育，在第6小时尚未见明显变化，但在第12、24、48小时的凋亡率分别为：36.0%、27.0%、25.0%。第48小时与24小时的凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

2.3 Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K 、p-Akt、Akt的蛋白表达 Western bloting结果显示：H2O2处理内皮细胞24 h后，与对照组比较，总Caspase-3的表达不变，活化的Caspase-3表达上调，用10 μmol/L的GSPB2预处理后，再加入H2O2，活化的Caspase-3表达下调(图2E)。同时Caspase-3的下游蛋白bax上调，Bcl-2上调(图2，A、B)。影响细胞凋亡的信号分子PI3K(图2D)明显增加；同时，p-Akt、Akt明显增加(图2C)。

3 讨 论

原花青素是一种天然多酚类化合物，是由不同数量的儿茶素、表儿茶素缩合而成的聚合体，因其具有极强的抗氧化活性和清除自由基能力，而被广泛应用于保健食品、护肤品及医药卫生等领域。以往的研究发现GSPE主要有以下作用，(1)调节血脂:GSPE能够降低血清TC、TG、LDL水平，同时升高HDL水平，而且还能够增加血清卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LACT)活性，调节胆固醇外流，减少胆固醇聚集，减轻泡沫细胞的聚集；(2)抗炎作用:GSPE主要通过下调细胞黏附分子的表达，减少单核细胞向内膜下的迁入以及抑制类花生烧酸合成酶的基因转录和酶活性,抑制炎性介质的产生，以及对NF-kB途径的调控等发挥其强大的抗炎作用,对类风湿性关节炎等多种急慢性炎性疾病都有很好的抗炎作用[7-9]；(3) GSPE可以抑制多种肿瘤细胞的生长并促进其凋亡，对抗血管内皮细胞损伤，抑制VSMC的增殖和迁移,发挥心血管保护效应，能够抑制心脏损伤时心肌细胞的凋亡等等。凋亡是由抗凋亡和促凋亡效应分子，如Bcl-2和Bax，所组成的复杂调控网络来调控的，Bax/Bcl-2比率升高会导致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的裂解且会诱导凋亡过程[10-12]。体内体外实验都证实与食物中不添加GSPs的无胸腺裸鼠体内生长的肿瘤内相关蛋白表达水平相比，GSPs可在鼠乳腺癌细胞(4T1)和人类鳞状细胞癌A431细胞中下调Bcl-2表达的同时上调Bax的表达，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表达水平增加。血管内皮功能紊乱则是AS的起始环节，与CHD的发生有密切的关系[14]，因此，保护内皮功能也已成为心血管疾病防治的重要目标之一。

Akt可以磷酸化Caspas-9前体(ProCaspas-9)从而阻断内源性蛋白酶的活性，已知ProCaspas-9是Caspas级联反应的起始蛋白酶，Caspas-9的活化可以激活Caspas-3、Caspas-6、Caspas-7等蛋白酶，在凋亡级联反应中起中间的转接作用，在凋亡调控中发挥主要功能。本实验发现：不同浓度的GSPB2可以有效保护血管内皮细胞延缓凋亡，作用的影响，而且是通过调节Akt磷酸化的方式发挥作用的[13]。

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Study on effect and mechanism of GSPB2 for protecting vascular endothelial cell and delaying apoptosis

Li Qiang1,Yang Chengming2△

(1.Department of Cardiology,Nanchuan District People′s Hospital，Chongqing 408400；2.Department ofCardiology,Daping Hospital,Third Military Medical University，Chongqing 400042,China)

[Abstract] Objective To observe the protective effect of GSPB2 for delaying the human endothelial cells apoptosis with H2O2induced human endothelial cells apoptosis as the model and to investigate its mechanism.Methods The human endothelial cells were pre-treated by 0.5 mmol H2O2,then different concentrations of GSPB2(5.0,10.0,20.0 μmol/L) was added for protecting cells.The cellular apoptosis was detected by TUNEL method;the apoptosis related molecules,such as Caspase-3,Bax,Bcl-2,and influencing apoptosis related molecules such as PI3K,p-Akt and Akt protein expression were detected by Western blot;Transwell chamber was used to detect cell migration situation.Results 0.5 mmol H2O2induced obvious increase of human endothelial cells (P<0.01).GSPB2 could significantly alleviate the H2O2induced apoptosis of human endothelial cells(P<0.05).10 μmol/mL GSPB2 could be close to return to H2O2untreated control group level.Further found that Caspase-3,Bax protein expression were up-regulaed,Bcl-2 expression was down-regulated and the expression of PI3K,p-Akt and Akt wa sup-regulated.Conclusion The different concentrations of GSPB2 has a protective effect on vascular endothelial cells induced by H2O2,moreover which manifested by the concentration and time dependence.Its mechanism is related with the related molecules PI3K,p-Akt and Akt

GSPB2;apoptosis;vascular endothelial cell

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.008

李强(1971-)，本科，副主任医师，主要从事高血压、冠心病的临床诊治方面的研究。△

，E-mail:yangchmi@163.com。

R54

A

1671-8348(2017)13-1753-03

2016-11-24

2017-01-12)