PI3K抑制剂LY294002联合吡柔比星对膀胱癌BIU-87细胞增殖作用的影响

张建武，李云祥，刘文虎，闵冬雨，唐兰，罗涛，陈卫

(1.川北医学院药理教研室，四川 南充 637100；2.南充市中心医院泌尿外科，四川 南充 637000；3.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；4.川北医学院病理生理教研室，四川 南充 637100)

PI3K抑制剂LY294002联合吡柔比星对膀胱癌BIU-87细胞增殖作用的影响

张建武1，李云祥2，刘文虎1，闵冬雨3，唐兰4，罗涛4，陈卫4

(1.川北医学院药理教研室，四川 南充 637100；2.南充市中心医院泌尿外科，四川 南充 637000；3.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；4.川北医学院病理生理教研室，四川 南充 637100)

目的：探讨PI3K抑制剂联合吡柔比星对人膀胱癌BIU-87细胞增殖作用的影响。方法：用不同浓度的PI3K抑制剂LY294002联合吡柔比星对BIU-87细胞作用0、12、24、36 h后，通过MTT方法检测抑瘤率；通过Western blotting检测Caspase-3、Bax、Bcl-2及P-gp蛋白的表达。结果：THP能明显抑制BIU-87细胞的增殖，并且具有明显的时间的依赖性 (P<0.05)。THP联合应用不同浓度LY294002组与单独使用同剂量的THP组比较，BIU-87细胞的增殖随着药物浓度的增加和时间的延长进一步受到抑制，而且，联合应用LY294002的低浓度THP组对BIU-87细胞抑制作用明显强于高剂量THP组(P<0.05)。此外， PI3K抑制剂LY294002联合应用THP后，BIU-87细胞Bax与Caspase-3表达都明显上升(P<0.05)， Bcl-2与P-gp表达量明显降低(P<0.05)。结论：PI3K抑制剂联合THP比单独应用THP对人膀胱癌BIU-87细胞抑制作用效果明显。

PI3K；LY294002；吡柔比星；BIU-87 细胞；

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，全球发病率占全身上皮肿瘤的5%[1]。吡柔比星(THP)是膀胱癌术后灌注以降低肿瘤复发率常用药。但是，由于肿瘤细胞对THP多重耐药(MDR)，致使经该药物治疗后，膀胱癌的复发率仍然较高[2-3]。因此，克服肿瘤细胞的MDR，探索新的临床用药方法是目前癌症治疗的一个难点。有资料显示PI3K抑制剂LY294002能逆转乳腺癌耐药蛋白介导的MCF-7/MXT细胞的MDR[4]。这提示PI3K抑制剂LY294002可能在反转肿瘤细胞MDR方面起到的关键作用。然而，临床上抗癌药物联合应用PI3K抑制剂LY294002治疗和预防膀胱癌复发方面的研究至今却鲜有报道，因此，本课题组通过研究PI3K抑制剂LY294002与THP联合用药对膀胱癌细胞的作用，初步探讨了其作用机制，为临床治疗膀胱癌探索新的方法并提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BIU-87细胞株(购于中国医科大学药学院)、细胞总蛋白抽提试剂盒(武汉博士德 中国)、RPMI 1640培养基(上海生物工程公司 中国)、优级胎牛血清(Hyclone 美国)、THP(THP深圳万乐药业有限公司)、PI3K抑制剂LY294002(上海江莱生物科技有限公司)；MTT、一抗兔抗人Bax抗体、兔抗人Bcl-2抗体、兔抗人Caspase-3抗体、兔抗人P-gp抗体、内参GAPDH(北京博奥森 中国)；山羊抗兔抗体(碧云天生物技术研究所)，倒置显微镜(OLYMPUS 日本)、CO2恒温培养箱(SANYO 日本)、凝胶图像分析系统(Bio-Rad 美国)、垂直电泳仪(Bio-Rad 美国)、半干电转仪(Bio-Rad 美国)、紫外分光光度计(Bio-Rad 美国)、常温离心机、低温冷冻离心机(Eppendorf 德国)、恒温孵育器(Eppendorf 德国)、超纯水处理系统(Millipore 美国)、精密电子天平(赛多利斯 中国)、酶标仪(Bio-Rad 美国)，超低温冰箱(SANYO 日本)

1.2 细胞培养

将BIU-87细胞株培养于含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素、链霉素的RPMI1640完全培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱内常规传代培养。隔天更换RPMI1640完全培养基，培养7 d为一代，细胞铺满培养瓶底后，进行分瓶培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 MTT细胞增殖实验

将处于对数生长期的 BIU-87 细胞用 0.25%胰酶-EDTA 溶液进行消化，制成2.5×104/mL细胞悬液。以每孔100 μL细胞接种于96 孔板，培养12 h至细胞贴壁后，加入抑制剂LY294002预作用1 h，使其终浓度分别为0 μM、10 μM、20 μM、40 μM，再分别加入THP(2 μg/mL和4 μg/mL)，共培养0、12、24、36 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，继续在细胞培养箱里培养4 h；小心吸去每孔中的培养基，每孔加入150 μL的DMSO，继续孵育10 min，然后将96孔避光放置于振荡仪上振荡 10 min，置于多功能酶标仪上，在490 nm波长处，测定每个孔的OD值。细胞增殖率：肿瘤细胞增殖率=(1-实验组细胞的 OD 值/对照组细胞的 OD 值)×100%。

1.4 细胞总蛋白提取

取培养后的对数生长期细胞，加入适当体积 0.25%胰酶-EDTA 溶液，使其能盖过细胞表面，放入培养箱孵育2 min，加入完全培养液终止消化。用移液器轻柔吹打，使细胞完全脱落，离心，用完全培养基清洗两次，重悬，调整细胞数5×105个/mL。将细胞接种于六孔板，每孔2 mL细胞悬液。随机将细胞分为PBS空白对照组、低剂量抑制剂LY294002组(10 μM)、高剂量抑制剂LY294002组(20 μM)、低剂量THP(2 μg/mL)+高剂量抑制剂LY294002(20 μM)组和高剂量THP(4 μg/mL)+高剂量抑制剂LY294002(20 μM)组。分别用各组试剂处理BIU-87细胞24 h，消化收集细胞，离心，弃去培养液，4 ℃ PBS清洗3次，加入细胞总蛋白抽提溶液100 μL(含NaCl 150 mM、叠氮钠 0.02%、SDS 0.1%、NP-40 1%，使用前加入100 μg/mL PMSF)，用移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。轻轻的摇晃5～10 min，冰上孵育，1～3 h充分裂解后，13 000 g 离心 10 min，取上清，-80 ℃保存备用。

1.5 Western blotting检测Caspase-3、Bax、Bcl-2及P-gp蛋白的表达

将蛋白样本上样于12 % SDS-PAGE凝胶中电泳，半干电转移10 V，30 min将蛋白转移到PVDF膜上，用0.5% 脱脂牛奶封闭1 h，TBST溶液清洗三次，每次5 min，然后分别用抗 Caspase-3 (1∶500 ) 、Bax (1∶1000) 、Bcl-2(1∶500) 、P-gp (1∶1000) 分别 4 ℃孵育过夜，TBST溶液清洗3次，每次5 min， 加入山羊抗兔 I g G抗体( 1∶500 ) 孵育1 h ，TBST溶液清洗三次，每次5 min。使用ECL试剂盒显色。采用Quantity one分析软件对条带进行灰度分析，以目的蛋白灰度值与GAPDH内参灰度值的比值来反映目的蛋白的相对表达水平。

1.6 统计学分析

每组实验独立重复3次，实验数据均表示为均数±标准误，差异比较采用 one-way ANOVA检验，由SPSS 19.0统计软件计算，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LY294002联合THP对BIU-87细胞增殖的影响

通过MTT细胞增殖实验显示，各组分别作用12、24、36 h后，与0时刻对照组比较，BIU-87细胞增殖率明显下降并存在时间依赖性(P<0.05) 。而THP联合应用不同浓度LY294002分别作用12、24、36 h后，与单独使用同剂量的THP实验组比较，BIU-87细胞的增殖率进一步降低(P<0.05)(表1)。

2.2 LY294002联合THP对Caspase-3、Bax、Bcl-2及P-gp蛋白表达的影响

使用不同浓度的LY294002和THP联合处理BIU-87细胞，抽取胞浆蛋白，检测胞浆中细胞增殖相关蛋白，结果显示，相对于空白对照组，单独给予20 μM PI3K抑制剂LY294002可使细胞内Bax表达增加(P<0.05)，而联合应用不同剂量的THP后，BIU-87细胞胞浆内的Bax与Caspase-3表达都明显上升，且具有一定的剂量依赖性(P<0.05)(图1A、1B)；另一方面，如将PI3K抑制剂LY294002单独作用于BIU-87细胞，胞浆内Bcl-2与P-gp表达降低(P<0.05)，而联合应用不同剂量的THP干预后Bcl-2与P-gp表达都明显降低(P<0.05)(图2A、2B)。

表1 THP联合不同浓度的LY294002 对BIU-87细胞 增殖的影响

组别剂量给药时间(h)01224362μg/mLTHP1±0．0780．805±0．068∗0．714±0．051∗0．561±0．079∗2μg/mLLY294002THP+10μM1±0．0310．835±0．053∗0．643±0．072∗#0．556±0．077∗2μg/mLLY294002THP+20μM1±0．0580．744±0．06∗#0．552±0．067∗#0．526±0．043∗#2μg/mLLY294002THP+40μM1±0．0720．705±0．066∗#0．479±0．092∗#0．412±0．061∗#4μg/mLTHP1±0．0640．803±0．072∗0．678±0．071∗0．478±0．048∗4μg/mLLY294002THP+10μM1±0．0590．881±0．072∗0．61±0．055∗#0．481±0．06∗4μg/mLLY294002THP+20μM1±0．0320．656±0．054∗#0．494±0．069∗#0．452±0．044∗#4μg/mLLY294002THP+40μM1±0．0580．573±0．074∗#0．402±0．061∗#0．442±0．066∗#

*P<0.05，与0时刻时肿瘤细胞增殖率比较；#P<0.05，与单用THP组肿瘤细胞增殖率的比较。

3 讨论

THP是全球治疗膀胱癌的首选药物，它是在阿霉素4立体位加上了四氢吡喃基而形成的一个四氢吡喃衍生物，对耐阿霉素肿瘤仍然有效[5]。该药物进入细胞核内抑制DNA聚合酶及DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoisomeraseⅡ，Topo Ⅱ)活性并迅速嵌入DNA核酸碱基对之间，干扰转录过程，阻止mRNA合成，干扰DNA合成，阻断细胞进入G1期而干扰瘤细胞有丝分裂、抑制肿瘤增殖，故具有较强的抗癌活性。近期研究还发现THP还能通过抑制雷帕霉素信号通路诱导人膀胱癌细胞自噬。然而，临床实践发现THP杀灭肿瘤并不完全，其复发率仍然较高且具有心血管毒性[6-8]。因此，THP联合其他药物，减少药物毒性，降低肿瘤复发率是目前膀胱癌治疗的重要课题。

3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)家族成员参与细胞增殖、分化、凋亡以及葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。而PI3K活性的升高常与多种癌症相关。PI3K激活后可分解为PIP3(三磷酸肌醇)进而激活AKT (蛋白激酶B)信号转导通路，调节其下游BAD、Caspase-9、mdm2和p21等癌基因家族蛋白表达和激活，从而调控细胞的增殖、分化和凋亡[9-11]。鉴于PI3K信号通路的活化与肿瘤复发、转移以及耐药产生有着密切联系。本研究采用THP联合PI3K抑制剂LY294002观察它对人膀胱癌细胞增殖的影响，来探索治疗膀胱癌，预防膀胱癌复发的新途径。LY294002是一种PI3K特异性的抑制剂，能通过细胞膜，靶向催化PI3K亚基p110，抑制AKT的磷酸化，从而阻断下游细胞转导信号的转导，抑制细胞增殖，甚至诱导凋亡。

有研究表明单独连续滴注和灌注THP可以明显降低膀胱癌细胞的复发和转移，提高患者的生存率[3,5]。在研究也发现单独给予THP能有效抑制人膀胱癌细胞的增殖，而联合LY294002用药后这种抑制作用更加明显，而且低浓度的THP联合LY294002用药明显强于单独使用高浓度THP对人膀胱癌细胞的抑制作用。这表明THP与LY294002之间存在相互协同作用，LY294002能明显改善和提高THP对肿瘤细胞生长的抑制作用。研究表明Bax和Bcl-2在细胞凋亡中起到重要作用，Bcl-2是从滤泡型B细胞淋巴瘤患者染色体中分离出来的一种癌基因，其表达的Bax能够抑制细胞凋亡，调控细胞的增殖，分化和凋亡，而Bax则能对抗Bcl-2，直接诱导细胞凋亡。二者在体内通常都以bax/bax和bcl-2/bcl-2二聚体的形式存在，当bcl-2/bcl-2过度表达，与bax形成异型bcl-2/bax二聚体，阻止bax/bax二聚体形成，则抑制细胞凋亡，反之，bax/bax二聚体大量表达则促进凋亡[12-13]。

进一步的研究显示单独使用LY294002仅能促进膀胱细胞中Bax表达量轻微上升而Bcl-2表达少量下降，有趣的是联合应用THP后，Bax、 Caspase-3的表达明显增加，而Bcl-2与表达则显著下降。这可能是由于单独使用LY294002仅能特异性抑制PI3K/AKT信号转导通路，不能抑制如MAPK、PKA和PKC等信号转导通路，因此抑制癌细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用较差，而加入THP后，由于其干扰DAN和mRNA合成及表达，干扰各种介导细胞增殖的信号转导通路的活化，在抑制剂LY294002作用下，PI3K信号通路被抑制，下游信号蛋白不能被激活，导致对抗THP药物作用的机制被阻断，药物产生的抑制效应明显加强，故而细胞增殖被抑制而凋亡增加。

本研究还观察到LY294002联合THP作用于膀胱癌细胞后，该细胞内P-gp的表达量也随LY294002浓度的增加而显著下降。大量的证据表明临床实验表明P-gp 表达的增加与肿瘤的浸润与转移密切相关，同时还证实P-gp持续表达可能是细胞发生癌变的标志[14]。P-gp是由肿瘤细胞mdr1基因编码的ATP依赖的药物输出蛋白泵，也是一种Ca2+和Cl-通道，其作用是与抗癌药物结合，利用ATP酶分解产生的能量或者离子通道将抗癌药物泵出细胞外，从而降低细胞内抗癌药物的浓度，达到耐药的目的[15-16]。因此，该蛋白的表达上调与癌细胞的耐药性产生有着密切关系。Kramer等[17]研究发现P-gp经糖基化修饰成170KD糖蛋白后，需要PKC介导将其磷酸化，才能完成P-gp完全输出泵功能，实现其多耐药功能。实验组P-gp的表达显著下降可能是由于PI3K信号通路被LY294002抑制，PI3K活性降低导致其产生的第二信使PIP3减少,以至其下游的信号蛋白AKT和PDK1(phosphoinositide dependent kinase-1)活性下降，其底物PKC(蛋白激酶C)、S6K(p70S6)等不能被激活，因此 P-g表达和形成减少。另一方面，由于PI3K信号通路被抑制，肿瘤细胞ATP生成障碍，从而使P-gp功能不能发挥，其药泵功能进一步下降，因此，在LY294002联合应用较低剂量的THP后，其抑制肿瘤细胞增殖作用较单一使用高剂量THP显著，但是以上推测是否正确，还需要进一步的研究证实。

目前，膀胱癌依然是威胁全人类的生命和生活质量的严重泌尿道疾病。THP虽然有效提高了膀胱癌患者生存率，但是也存在复发率高，副作用大的问题。PI3K抑制剂联合THP治疗膀胱癌可使低剂量的药物具有高剂量药物相同的抑瘤效应，有利于降低药物的毒副作用，也许在将来的膀胱癌的治疗上具有广阔的应用前景。

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(学术编辑：罗蕾)

Effects of the proliferation of human bladder cancer cells BIU-87 after PI3K inhibitor LY294002 and pirarubicin combined treatment

ZHANG Jian-wu1,LI Yun-xiang2,LIU Wen-hu1,MIN Dong-yu3,TANG Lan4,LUO Tao4，CHEN Wei4

(1.DepartmentofPharmacology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637100；2.DepartmentofUrology,NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan；3.AffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,Liaoning；4.DepartmentofPathophysiology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637100,Sichuan,China)

Objective：To investigate the effects of PI3K inhibitor LY294002 combined with Pirarubicin (THP) on proliferation of human bladder cancer cells BIU-87.Methods：The BIU-87 cells were treated by the different concentration of LY294002 and THP for 0,12,24,36 h.The tumor inhibition rate was measured with MTT.The Bax,Bcl-2,Caspase-3 and P-gp of BIU-87 cells were detected by Western blotting.Results：THP could significantly inhibit the proliferation of BIU-87 cells and had a significant time dependence (P<0.05).Compared the THP combined with different concentration of LY294002 groups and used alone at the same dose in THP group,the proliferation of BIU-87 cells increased with the increase of drug concentration and time further inhibited,and the low concentration THP group combined with LY294002 on the inhibition of BIU-87 cells was stronger than the high dose THP group (P<0.05).Furthermore,the expressions of Bax and Caspae-3 in cytoplasm of BIU-87 cells treated by LY294002 and THP were increasing more than the control group(P<0.05),while the expressions of Bcl-2 and P-gp were decreasing(P<0.05).Conclusion：It is better inhibiting effect on BIU-87 cell to use LY294002 and THP combined treatment than only THP.

PI3K;LY294002;THP;BIU-87 cell

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.02.010

四川省教育厅科研项目(14ZB0188)；川北医学院校级重点培育项目(CBY13-A-2P20)

2016-09-17

张建武(1980-)，男，硕士，副教授。E-mail：546815404@qq.com

陈卫，E-mail：346998279@qq.com

时间：2017-5-5 16∶46

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170505.1646.020.html

1005-3697(2017)02-0189-04

R737.14

A