不同剂量分割模式照射Eca109细胞TNF和SODD的表达

蔡红伟，马代远，李贤富，周进伟 ，蒲宇，董灵，谭榜宪

(1.川北医学院附属医院肿瘤科；2.医学影像四川省重点实验室；3.阆中市人民医院，四川 南充 637000)

不同剂量分割模式照射Eca109细胞TNF和SODD的表达

蔡红伟1,3，马代远1，李贤富1，周进伟1，蒲宇2，董灵3，谭榜宪1

(1.川北医学院附属医院肿瘤科；2.医学影像四川省重点实验室；3.阆中市人民医院，四川 南充 637000)

目的：通过模拟不同剂量分割方式照射食管癌细胞Eca109，观察比较各组别凋亡相关基因肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和死亡结构域沉默子(silencer of death domains,SODD)的各组别表达差异并分析原因及意义，尝试为临床实施的非常规放疗提供潜在基础理论依据。方法：设计具有相同BED的4种剂量分割模式，照射处于指数生长期的Eca109细胞后，RT-PCR检测各组TNF mRNA和SODD mRNA表达变化，Western Blot检测各组TNF 蛋白和SODD蛋白表达变化。结果：各组TNF mRNA及蛋白的表达量均数差值比较，有显著性差异；各组SODD mRNA及蛋白的表达均数差值比较，有统计学意义。结论：模拟照射各组中超分割组TNF mRNA表达上调幅度最大，SODD mRNA上调幅度亦最大。提示在射线诱导肿瘤细胞以某种方式走向死亡过程中，存在着促凋亡基因和抗凋亡基因之间的博弈。模拟照射各组中TNF蛋白和SODD蛋白均大部分下调，提示除DNA是射线的主要损伤靶点外，射线对其他细胞器的损伤作用亦不容忽视，因为它们的功能状态可能影响到蛋白质的合成。

剂量分割；Eca109；肿瘤坏死因子；死亡结构域沉默子

食管癌是我国常见的恶性肿瘤，占恶性肿瘤死亡率第四位[1]。放射治疗作为食管癌治疗的三大手段之一，遗憾的是几十年来常规的剂量分割模式(1.8～2.0 Gy/Fx，5 Fx/w)治疗疗效没有得到明显提高。近年来随着以三维适形和调强放疗为代表的新技术越来越多地应用于临床，在不增加正常组织损伤的前提下进行食管癌的非常规剂量分割放疗成为一个研究热点。然而目前存在的问题是针对食管癌放疗剂量分割的研究，临床课题多，基础研究少，故本实验通过模拟不同剂量分割方式照射Eca109细胞，观察肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和死亡结构域沉默子(silencer of death domains,SODD)基因及蛋白的表达变化，并分析两者的关系，尝试为临床选择非常规分割放疗治疗食管癌提供潜在的基础理论依据。

TNF是由多种细胞合成、释放并引起全身系统性炎症反应的细胞因子,其对细胞本身而言具有促凋亡和促增殖的双重作用。目前人们对于TNF促凋亡与促增殖之间的关系及机制仍不清楚。SODD主要是在肿瘤坏死因子受体1 (tumor necrosis factor receptor1,TNF-R1)信号传导通路中充当负调节子，阻止TNF-R1信号传导通路呈持续激活状态，稳定内环境，维持正常组织细胞稳态。

1 材料与方法

1.1 细胞系与主要试剂

人食管癌Eca109细胞株购于上海凯基生物。在含10%小牛血清的RPMI1640培养液中常规培养传代，当细胞处于指数生长期时进行后续实验。RT-PCR反应试剂盒购于天根公司，Western Blot 试剂盒购于碧云天公司。TNF，SODD及内参(ACTB)引物由上海生工合成，引物序列详见表1。TNF抗体购于Sigma公司，SODD抗体购于Prosci公司。

表1 TNF，SODD及内参(ACTB)的引物序列

1.2 模拟照射各组具体方案设计

取对数生长期的Eca109细胞进行模拟不同剂量分割方式照射，模拟照射分为超分割组，常规照射组，大分割组，大分割组又分两个亚组。同时设置空白对照组(未照射组)。设计原则：各照射组之间等效生物剂量基本相同。根据等效生物剂量的换算公式：EQD2=nldl[(d1 +α/β)/(2 +α/β)],α/β值取肿瘤细胞常用值10 Gy。EQD2:超分割组(1)=10.175 Gy ；常规分割(2)=10.000 Gy；大分割组(3)=9.750 Gy；大分割组(7)=9.917 Gy。其中超分割组照射时两次时间间隔不小于6 h[2]。具体照射方案设计见表2。

表2 模拟不同剂量分割照射设计方案(Gy)

0组代表空白对照(未照射)；1组代表超分割组(1.1 Gy/Fx)；2组代表常规分割(2 Gy/Fx)；3组代表大分割组(3 Gy/Fx)；7组代表大分割组(7 Gy/Fx)。

1.3 模拟照射参数设置

医科达Precise直线加速器由川北医学院附属医院肿瘤科提供，在模拟照射过程中其具体参数设置如下：射线能量：6 MV X-ray；机架角：180°；机头角：0°；照射野大小：10 cm×10 cm；照射源距肿瘤细胞(培养瓶底壁)距离：100 cm；设定剂量率：600 MU/min (实际剂量率：500 MU/min)；剂量建成：培养瓶下垫1 cm厚硅胶。

1.4 RT-PCR检测TNF mRNA和SODD mRNA基因表达

模拟不同剂量分割方式照射Eca109细胞完成后继续培养12～24 h，进行模拟照射各组总RNA的提取，空白对照组同时进行。按照RT-PCR试剂盒说明书步骤进行总RNA提取，逆转录，聚合酶链反应(PCR)及琼脂糖凝胶电泳成像。通过凝胶成像仪观察结果，用凝胶成像系统自带Image Lab 软件进行成像，并测其灰度值，根据目的基因条带与内参条带的灰度比值代表其mRNA 表达水平，进行半定量分析。

1.5 Western Blot检测TNF和SODD蛋白表达

模拟不同剂量分割方式照射Eca109细胞完成后继续培养12～24 h，进行模拟照射各组总蛋白的提取，空白对照组同时进行。按照Western Blot试剂盒说明书进行蛋白变性，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育及蛋白显像等常规步骤。通过凝胶成像仪观察结果，用凝胶成像系统自带Image Lab 软件进行成像，并测其灰度值，根据目的蛋白条带与内参条带的灰度比值代表其蛋白表达水平，进行半定量分析。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1TNFmRNA和SODDmRNA基因表达

各组TNFmRNA的表达量均数差值比较：0组与3组为0.10(P=0.01)；0组与7组为0.14 (P=0.00)；1组与3组为0.13(P=0.00)；1组与7组为0.18(P=0.00)； 2组与3组为0.09(P=0.03)；2组与7组为0.13(P=0.00)；有统计学意义(表3、表4)。

各组SODDmRNA的表达均数差值比较：0组与1组为0.39(P=0.00)；0组与3为组0.14(P=0.03)；1组与组2为0.33(P=0.00)；1组与3组为0.25(P=0.00)；1组与7组为0.13(P=0.04)；2组与7组为0.13(P=0.00)；有统计学意义(表3、表5)。

2.2TNF和SODD蛋白表达

各组TNF蛋白表达量均数差值比较：0组与1组为3.30(P=0.00)；0组与2组为4.98(P=0.00)；0组与3组为5.39(P=0.00)；0组与7组为4.61 (P=0.00)；有统计学意义(表6、表7)。

各组SODD蛋白量均数差值比较：0组与1组为0.67(P=0.00)；0组与2组0.68(P=0.00)；0组与3组为0.76(P=0.00)；1组与7组为0.80(P=0.00)；2组与7组为0.82(P=0.00)；3组与7组为0.90(P=0.00)；有统计学意义(表6、表8)。

组别TNFmRNASODDmRNA00．36±0．070．69±0．1010．39±0．071．06±0．1120．35±0．060．76±0．0830．25±0．050．84±0．0970．21±0．040．96±0．10

表4 TNF mRNA在正常Eca109细胞及模拟不同剂量分割方式照射后的表达量多组比较结果(LSD法)

(I)组别(J)组别均数差值(I-J)标准误P值01-0．030．030．3820．010．030．7730．100．030．0170．140．030．00100．030．030．3820．040．030．2430．130．030．0070．180．030．0020-0．010．030．771-0．040．030．2430．090．030．0370．130．030．0030-0．100．030．011-0．130．030．002-0．090．030．0370．040．030．2570-0．140．030．001-0．180．030．002-0．130．030．003-0．040．030．25

表5 SODD mRNA在正常Eca109细胞及模拟不同剂量分割方式照射后的表达量多组比较结果(LSD法)

(I)组别(J)组别均数差值(I-J)标准误P值01-0．390．060．002-0．060．060．323-0．140．060．037-0．260．060．00100．390．060．0020．330．060．0030．250．060．0070．130．060．04200．060．060．321-0．330．060．003-0．070．060．2470．130．060．00300．140．060．031-0．250．060．0020．070．060．247-0．120．060．06700．260．060．001-0．130．060．0420．190．060．0030．120．060．06

组别TNF蛋白SODD蛋白05．52±3．431．00±0．2312．22±1．690．32±0．0720．54±0．370．31±0．0730．12±0．090．23±0．0470．90±0．701．13±0．27

表7 TNF 蛋白在正常Eca109细胞及模拟不同剂量分割方式照射后的表达量多组比较结果(LSD法)

(I)组别(J)组别均数差值(I-J)标准误P值013．301．100．0024．981．100．0035．391．100．0074．611．100．0010-3．301．100．0021．681．100．1432．091．100．0771．311．100．2420-4．981．100．001-1．681．100．1430．411．100．7170．361．100．7430-5．391．100．001-2．091．100．072-0．411．100．717-0．411．100．4870-4．611．100．001-1．311．100．2420．361．100．7430．781．100．48

表8 SODD蛋白在正常Eca109细胞及模拟不同剂量分割方式照射后的表达量多组比较结果(LSD法)

(I)组别(J)组别均数差值(I-J)标准误P值010．670．100．0020．680．100．0030．760．100．007-0．130．100．2210-0．670．100．0020．010．100．8730．090．100．377-0．800．100．0020-0．680．100．001-0．010．100．8730．070．100．467-0．820．100．0030-0．760．100．001-0．090．100．372-0．070．100．467-0．900．100．00700．130．100．2210．800．100．0020．820．100．0030．900．100．00

3 讨论

TNF和SODD同为TNF-R1信号传导通路相同受体的竞争性配体，肿瘤细胞受到损伤(辐射或药物)诱导凋亡后两者表达有怎样的变化，本实验通过模拟不同剂量分割方式照射细胞Eca109后检测两者基因和蛋白的表达情况探索不同剂量分割方式在基因和蛋白层面的影响。

TNF mRNA的表达量超分割组较空白对照上调，但无显著差异，常规分割较空白对照下调，亦无显著性差异。大分割组(3)及大分割组(7)较其他 3 组明显下调(图1、图3)。X射线照射细胞后通过诱导细胞以某种方式走向死亡，结合我课题组既往研究结果，射线损伤细胞后TNF扮演了促凋亡的角色，所以，超分割组在所有组别中表达量最高。但是其他模拟照射组表达量却均降低，尤其在大分割的两个组特别明显，可能与细胞表现的死亡方式有关[3-6]。

SODD mRNA的表达量模拟照射各组均较未照射组表达上调，其中，超分割组上调最明显，大分割组(7)次之，常规分割与大分割组(3)较空白对照均无显著性差异(图1、图3)。

SODD在TNF-R1信号转导中是一个负调节子(沉默子)，与TNF竞争性结合TNF-R1，阻断TNF-R1信号转导通路呈持续激活状态，稳定内环境，维持正常组织细胞稳态。理论上，若组织细胞中SODD过表达，必将负调节TNF的最重要的生物学效应(细胞凋亡)，从而使细胞免于TNF诱导的凋亡，出现永生性恶化甚至癌变；肿瘤细胞中若SODD过表达，将导致肿瘤细胞对细胞表面死亡受体介导的凋亡敏感性降低，对放射线和化疗药物表现出耐受性。国内外的几项研究均认为具有抗凋亡功能的SODD的过表达意味着肿瘤的进展或未控，而表达下调则预示着肿瘤受抑[7-9]。

凋亡的激活在很大程度上依赖于促凋亡基因及其蛋白与抑凋亡基因及其蛋白的博弈与平衡[10-11]。本实验中模拟照射各组SODD mRNA均较空白对照组表达上调，可能正是Eca109细胞射线损伤后发生的代偿性改变,为了避免死亡的发生，而与TNF产生的对抗。这一点在超分割组中表现尤为明显，超分割组TNF mRNA表达上调幅度最大，SODD mRNA上调幅度亦最大。

TNF蛋白分子量为17 kD，其活性形式是三聚体(51 kD)，本实验的结果发现在彩色预染蛋白分子量标准约51 kD处有大量的蛋白印迹，而17 kD位置蛋白印迹浅显(图4)，这与相关文献吻合[12-14]。故课题组在进行灰度值比对时采取测量TNF三聚体以获得实验数据。TNF蛋白的表达量模拟照射各组均较未照射组表达下调，且均有显著性差异。各模拟剂量分割照射组之间无显著性差异(图2、图4)。SODD蛋白表达量各模拟剂量分割照射组除了大分割组(7)均表达下调，且均有显著性差异。大分割组(7)较空白对照表达上调，但差异无统计学意义。表达下调的各组之间亦均无显著性差异(图2、图4)。

模拟不同剂量分割方式照射各组细胞TNF，SODD蛋白的表达情况出现了与各自mRNA表达不一致的结果。其原因可能是mRNA翻译成蛋白的过程中出现了差错。但具体机制并不清楚，可能与射线对核糖体(蛋白质合成的场所)，内质网，线粒体高尔基体等细胞器的破坏作用有关。

从本实验RT-PCR和Western Blot的结果可以看出：在射线诱导肿瘤细胞以某种方式走向死亡过程中，可能存在着促凋亡基因和抗凋亡基因之间的博弈，若促凋亡基因占优势，则肿瘤细胞走向死亡，若抗凋亡基因占优势，则肿瘤细胞加速增殖。另一方面，促凋亡基因表达升高，可能会反应性地引起抗凋亡基因的表达上调[10-11]。这是否可提示临床上不能因为一个基因的表达变化而推断疾病的转归。然而，这种基因之间的博弈也是动态变化的，本实验的不足之处在于因为实验条件与时间的限制，未能在多个时间点检查这两个基因的表达，而只是在模拟照射结束后第1天进行检测，未能进行动态研究。射线对细胞的损伤效应远比我们目前知道的复杂的多，本实验中两个凋亡相关基因的蛋白受射线照射后下调，与mRNA的表达升高不一致，提示出来DNA是射线的主要损伤靶外，射线对其他细胞器的损伤作用亦不容忽视，因为它们的功能状态可能直接影响到肿瘤细胞的增殖与凋亡状态。但是目前放射肿瘤学少有关于放射线对DNA以外的其他细胞器损伤的理论与基础研究。

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(学术编辑：杜小波)

Expression of TNF and SODD in Eca109 cells under different dose fractionation mode irradiation

CAI Hong-wei1，3，MA Dai-yuan1，LI Xian-fu1，ZHOU Jin-wei1，PU Yu2，DONG Ling3，TAN Bang-xian1

(1.DepartmentofOncology，AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege；2.SichuanKeyLaboratoryofMedicalImaging；3.LangzhongPeople’sHospital,Nanchong637000，Sichuan，China)

Objective：Hope to provide some theoretical basis for unconventional radiotherapy,we observe and compare expression of apoptosis related genes (TNF and SODD)between groups by simulating different dose fractionation on esophageal cancer cells Eca109.Methods：Design the dose fractionation mode with the same BED.Irradiation is exponential growth phase Eca109 of cells.Detect TNF mRNA and SODD mRNA，expression in each group with RT-PCR on the first day after simulation irradiation.Detect TNF protein and SODD proteins，expression in each group with Western Blot on the first day after simulation irradiation.Results：Mean differences of the TNF mRNA’s and protein’s expression quantity in each group were compared,all were statistically significant;Mean differences of the SODD mRNA’s and protein’s expression quantity in each group were compared,all were statistically significant.Conclusion：Among the simulation irradiation groups,the hyperfractionated group’s TNF mRNA’s expression was the highest,so was SODD mRNA.It suggests that a fight should exist between promoting apoptotic genes and anti-apoptotic gene in the process of induced tumor cells’ dying.In the analog irradiation groups,both TNF protein and SODD protein suffered massive reduction.It suggests that injury of other organelles except DNA can not be ignored,because their functional status may affect the synthesis of protein.

Dose fractionation;Eca109;Tumor necrosis factor;Silencer of death domains

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.02.001

中央财政支持地方高校发展专项资金(2010-2012年)；四川省教育厅重点课题(11ZA191)；南充市科技支撑计划项目(11A0149)

2016-09-01

蔡红伟(1982-)，男，硕士,主治医师。E-mail：chw69940@126.com

谭榜宪，E-mail：tbx_nsmc@126.com

时间：2017-5-5 16∶46

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170505.1646.018.html

1005-3697(2017)02-0155-05

R392.11

A