冷沉淀凝血因子制备技术的应用研究

2017-06-05毕承恩马佩琴罗晓梅欧阳克梅

临床医药文献杂志(电子版) 2017年1期

关键词：血友病凝血因子冰冻

毕承恩，杨婷，马佩琴，罗晓梅，欧阳克梅，程勤，郭琼

（昭通市中心血站，云南昭通 657000）

冷沉淀凝血因子制备技术的应用研究

毕承恩，杨婷，马佩琴，罗晓梅，欧阳克梅，程勤，郭琼

（昭通市中心血站，云南昭通 657000）

目的通过研究冷沉淀凝血因子的制备技术和推广应用，开发新的血液品种，提高输血疗效和水平。方法采集全血迅速制备成新鲜冰冻血浆后速冻，-18℃以下冰箱保存，通过融化、离心、分离、速冻等工序制备出冷沉淀凝血因子，并对其进行抽样检测。结果通过检测188袋成品冷沉淀凝血因子，0.75 U冷沉淀凝血因子FⅧ含量（131.27±32.32）IU/袋、Fg含量（132.43±23.48）mg/袋，1 U冷沉淀凝血因子FⅧ（146.13±32.67）IU/袋、Fg含量（161.93±14.08）mg/袋，符合国家《全血及成分血质量要求》标准。结论制备的冷沉淀凝血因子质量合格，临床疗效显著，保障了凝血因子Ⅷ、凝血因子ⅩⅢ、纤维蛋白原、血管性血友病因子缺乏患者治疗的需要，特别是在ICU、创伤性大出血、产科DIC时抢救了大量的患者，产生显著的经济效益和社会价值，值得推广应用。

冷沉淀凝血因子；应用；制备技术；研究

冷沉淀凝血因子是将保存期内的新鲜冰冻血浆在1～6℃的温度下，将大部份血浆分离，不溶解的部分物质使其在1h内速冻呈固态成分血的过程[1]。其中含丰富的凝血因子Ⅷ（FⅧ）、、凝血因子ⅩⅢ（FⅩⅢ）血管性血友病因子（von Willebrand因子，VwF）、纤维蛋白原（Fg）以及纤维结合蛋白（Fn）等成分[2]，广泛应用于血液性疾病的手术及创伤引起的凝血性功能障碍性疾病[3-7]。我站于2012年开展此制备技术，并大量应用于临床，效果显著，值得推广应用。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

MBF-21多美达速冻机、海尔-80℃低温冰箱、BLT-1.35B低温工作台、KJX-Ⅲ低温水浴冰冻血浆解冻箱、SIGMA 8K大容量低温离心机、CR7大容量低温离心机、CA-50凝血酶仪、INKUBATOR1000恒温震荡孵育箱、T5000型电子天平、CZK-IC微电脑采液控制器、天津天商冰源冷库。

1.2 试剂

凝血Ⅷ因子试剂、FB试剂、APTT试剂、因子Ⅷ缺乏血浆均由德国Dade Behring Marburg公司提供，质控血清由卫生部临检中心提供，均在有效期内使用。

1.3 血袋

山东威高集团医用高分子制品有限公司四联血袋

1.4 制备

采集全血后，6 h内离心分离出血浆置MBF-21多美达速冻机中30 min内将血浆中心温度降至-30℃以下，-18℃以下冰箱保存至少7天备用。制备可以把冰冻的血浆放入4℃的水浴中融化，融化过程中轻微摇动血浆，当血浆基本融化时，取出冰冻血浆，于大容量低温离心机在（4±2）℃以2547 g的离心力离心10 min，将大部分上层血浆移至空袋，制成冰冻血浆，留下的不溶解的白色胶状物即为冷沉淀凝血因子，与20～30 mL血浆混合制成冷沉淀凝血因子[8]，迅速置MBF-21多美达速冻机中速冻（1 h内），-18℃以下冷冻保存。当使用的时候，将冷沉淀放入37℃的水浴中进行融化后尽快输注。

1.5 检测标本

临床推广前，通过检测20袋成品冷沉淀凝血因子，质量合格后常规开展工作，每月随机抽检4袋成品冷沉淀凝血因子作为检测标本。

1.6 FⅧ和Fg检测方法

每月抽样标本在CA-50凝血酶仪上分别进行检测，测定出FⅧ和Fg的值后，再根据容量、稀释倍数计算出FⅧ和Fg含量。

1.7 质量标准

《全血及成分血质量要求》GB18469-2012中，来源于300 mL的全血（0.75U）： FⅧ含量≥60 IU/袋，Fg含量≥113 mg/袋；来源于400 mL的全血（1U）： FⅧ含量≥80 IU/袋，Fg含量≥150 mg/袋。

2 结果

2012～2015年我站共制备冷沉淀凝血因子19926袋，17478.5 U，质量抽检188袋。检测结果见表1。

表1 2012年-2015年冷沉淀凝血因子抽检检测结果（s）

0.75 U 123 39.51±6.54 131.27±32.32 132.43±23.48 1 U 65 38.42±7.14 146.13±32.67 161.93±14.08

2012～2015年向我市临床用血机构推广冷沉淀凝血因子19100袋，共计16693.75 U，其中昭通市第一人民医院使用10833.75 U，占总使用量的64.89%，主要用于ICU、创伤性大出血、产科大出血、上消化道大出血、心胸颅脑大手术和凝血因子Ⅷ、凝血因子ⅩⅢ、纤维蛋白原、血管性血友病因子缺乏的血液系统疾病，临床应用未发现输血不良反应，临床使用效果显著，其使用情况见表2、表3。

表2 2012～2015年主要使用冷沉淀凝血因子医疗机构统计表

表3 2013～2015年市一院临床科室使用冷沉淀凝血因子统计表

3 讨论

3.1 冷沉淀凝血因子制备的干扰因素和注意事项

由于Ⅷ因子属不稳定的凝血因子，容易失活，从血液采集到制备过程中采血、制备、速冻、保存的时间和温度都会影响冷沉淀凝血因子活性，因此冷沉淀的制备应注意以下几点：

1）顺利完成静脉穿刺、采血过程快速且要准确无误，并尽快让血液及抗凝剂充分的混合作为保证冷沉淀中Ⅷ因子保持高度活性的必要条件[9]。300 mL全血采集时间＞10 min、 400 mL全血采集时间＞13 min不可用于制备原料新鲜冰冻血浆。

2）血液采集后立即放冰箱保存，用专用血液运输箱运输血液，制备时使用低温工作台，确保血液采集后保存、运输和制备过程始终置2～8℃环境，避免凝血因子降解。

3）新鲜冰冻血浆要求在4～6 h内制备完成，此时间越短则Ⅷ因子的回收率越高。选留做冷沉淀凝血因子的新鲜冰冻血浆应澄清、无色泽异常、无乳糜和蛋白析出。

4）新鲜冰冻血浆要快速将中心温度降至-30℃以下，-18℃以下冰箱保存至少7天备用。短时间内速冻血浆并低温储存7天以上，有利于新鲜冰冻血浆中不稳定凝血因子的稳定和抱团，制备过程中解冻离心时的温度最好控制在1～6℃。

5）不同的冰冻血浆融化方法可对Ⅷ因子的产量产生不同的影响。融化的方法一般分为两种:速融及慢融。慢融多放在4℃冰箱过夜自然融化，不易控制；速融使用低温水浴冰冻血浆解冻箱中1～6℃快速融解，容易控制时间，减少人为因素影响，制备出凝血因子质量更好[10]。

6）制备时采用离心法比虹吸法效果好。

3.2 冷沉淀凝血因子的主要成分及作用机理

我站冷沉淀凝血因子是由300 mL与400 mL的全血分离出的新鲜冰冻血浆加工而成，将400 mL的全血分离血浆所制成的冷沉淀凝血因子为1个单位，其中冷沉淀凝血因子含FⅧ80～120 IU、VwF因子20%～30%、ⅩⅢ因子20%～30%、纤维蛋白原150～250 mg，纤维结合蛋白500 mg[11]。我站抽检的冷沉淀凝血因子每单位含FⅧ 115～170 IU、纤维蛋白原150～180 mg。

沉淀凝血因子的作用机制如下。

1）凝血因子Ⅷ（FⅧ）。FⅧ又称抗血友病球蛋白，是冷沉淀中最主要凝血因子，是以单链形式被合成，但在血浆中，它是以由两条在不同位点被酶切的单链（一条重链和一条轻链）组成的异二聚体再和Von Willebrand 因子形成的复合物形式存在。其功能是作为因子Ⅸa的辅因子参与因子Ⅸa对因子X的激活[11]，促进凝血酶原转化为凝血酶，凝血酶可将因子Ⅻ激活为纤维蛋白稳定因子（Ⅻa），而纤维蛋白多聚体进一步通过交联而形成相对稳固的血栓，从而达到止血的效果。

2）纤维蛋白原（Fg）。Fg又称凝血因子I，是凝血过程中一连串具有蛋白水解活性的凝血因子相继激活的最终底物。凝血的最后一步即凝血酶的形成，作用于纤维蛋白原使之转变为纤维蛋白。它还是血小板间的桥梁，与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅱa结合而介导血小板发生聚集反应，其含量增高可使血小板的聚集功能发生改变[12]。Fg可以多种不同的方式与生物组织进行结合，从而发挥其止血及填充的作用，可以有效改善微循环，进而达到防止出血的目的。

3）凝血因子ⅩⅢ（FⅩⅢ）。FⅩⅢ曾称纤维蛋白稳定因子，是由2个α亚单位和2个β亚单位组成的四聚体，活性中心位于α亚单位。它在凝血过程中的主要作用是催化相邻的纤维蛋白单体通过在其γ链及α链上的赖氨酸和谷氨酸残基之间形成ε（γ-氨酸）赖氨酰键而共价交联，使改变可溶性纤维蛋白的性质，促进稳固纤维蛋白形成凝块。

4）纤维接合蛋白（fibronectin，Fn）。又叫纤维连接/粘连蛋白，作为相对分子质量较高的糖类蛋白质，可以有效促进纤维蛋白交联、上皮细胞移行、细胞粘着、修复及分化的功效，同时具备止血及封固的作用。同时作为一种“趋化因子”，它能与衰老细胞、组织碎片、纤维蛋白复合物、纤维蛋白和细菌等结合，并促进单核细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞迁移到创伤处，促进吞噬、净化伤口，具有抑菌、抗感染的作用[13]，并与成纤维细胞、纤维蛋白凝块共同形成支架的作用，最终促进细胞的生成与合成，促进DNA的合成[14]，从而促进伤口的愈合和组织的修复。另外，作为粘附结构蛋白Fn可充当间质，相互粘附，加固不同细胞之间发生结合，对肿瘤细胞的扩散起到阻碍作用。

5）血管性血友病因子（VwF）。VwF是一种血管蛋白，由血管内皮细胞和巨噬细胞合成，由不同量的亚单位组成的多聚体，相对分子质量从50万到数百万不等。VwF的功能是作为因子Ⅷ的载体而对因子Ⅷ起稳定作用，可使血小板粘附至胶原上，从而参与血小板的粘附、聚集功能。

3.3 临床应用

3.3.1 在外科中应用

各种原因大出血如车祸伤、肝胆外科等所引发的严重失血，失血量越多，凝血因子丢失的也就越多，故如何有效的减少出血量，是进行患者抢救的关键，通过输入悬浮红细胞及大量冷沉淀可以有效且迅速对凝血因子进行补充，按1～1.5单位/KG体重进行输入，例如体重为60 kg的患者出血2000 mL可以总计输入8个单位（一个治疗量），如此同时配合血小板1～2个治疗量可以提高疗效。另外当发生严重的创伤、手术性创伤及感染时，患者的血浆会因消耗大量的纤维结合蛋白而显著降低纤维结合蛋白的水平，大大降低网状内皮系统吞噬功能，抑制机能消除异物的能力。冷沉淀含丰富的纤维结合蛋白与凝血因子，可以通过改善内脏微血管的功能来防治内脏的过量出血。早期及时输注冷沉淀，可对严重创伤及手术创伤患者血浆中的纤维结合蛋白活性进行有效的提高，增强血浆中网状内皮系统防御吞噬能力，有效防止伤口感染，提高被损伤的血管与创伤的组织自身的修复能力，使患者早日康复出院。

行肝脏手术的患者术后肝功能受到严重损伤，与此同时会出现多重的凝血功能异常。原因大致可分为凝血因子的消耗增多与其合成功能受阻；血液中纤维蛋白溶酶含量的增多促使纤溶亢进及血小板的生成功能减退。诸多的原因使创面的愈合发生困难，此时在手术中为患者输入冷沉淀便可以效地改善机体的凝血机制，提高术后伤口组织的愈合及恢复，从而避免在术中发生大出血，在提高肝移植手术安全性及成功率方面作用毋庸置疑。

弥散性血管内凝血（DIC）是以血管内凝血系统激活与血管内纤维蛋白沉着作为主要的特征，且过程常继发出现纤溶或者纤溶受抑的综合症，DIC并不是一种单独发生的疾病，而是多种严重基础疾病如感染、病理产科、恶性肿瘤、大型手术及创伤等所致的病理性发生过程，严重出血是临床的主要表现，并且伴随着各脏器的障碍，内脏微循环的栓塞，微血管出现病理性溶血性贫血等各种临床症状。通常见DIC的病理生理过程，分为高凝血期、消耗性低凝血期和继发性纤维蛋白溶解亢进期。DIC低凝期为凝血因子被大量消耗的时期，FV、FⅧ 、纤维蛋白原和血小板的缺乏最严重，同时其他的凝血因子水平也会持续不同程度的下降，常常会有继发的纤维蛋白溶解性发生，治疗DIC首先是去除诱发因素，在此基础上控制出血和血栓，因此及时对患者体内凝血因子进行有效的补充是抢救患者脱离危险的关键，甚至可以决定患者抢救的成功与否，而冷沉淀含有大量的因子Ⅷ、VwF、ⅩⅢ和Fn，是补充凝血因子的最好制品，但应在充分抗凝基础上方可使用[15]。联合使用冷沉淀8～10 U（1.5单位/10 Kg体重）和血小板1～2个治疗量，效果更好。

恶性肿瘤的患者因机体长期在消耗状态下，患者的造血功能极为低下，血浆的凝血因子合成的量比消耗的要少。而冷沉淀中含有丰富的FⅧ、Fg、VwF、FⅩⅢ以及纤维结合蛋白，这类因子可以有效提高患者体内的凝血因子的含量，减少凝血酶原时间（PT）及活化部分凝血活酶时间（APTT），提高FIB，可以有效改善患者在手术中的止血现象。有报道描述冷沉淀可以通过对纤维蛋白膜的形成，对手术的创面产生机械性的牵拉性作用，对创口的收缩起到有效促使用药，对促进肿瘤患者后期放疗口腔溃疡的创面的愈合发挥积极作用。

在接受心脏外科手术的患者手术中因发生体外循环、血液稀释、血小板的破坏、机体体温的变化以及凝血因子的消耗随之出现凝血功能的障碍，常以出血与渗血为主要症状。对比除了对血液采取保护措施外，对患者进行及时有效的成分输血可以显著改善患者的凝血功能异常，大大降低术后大出血的发生率。冷沉淀中具有丰富的FⅧ、FIB及VwF，可缩短FX活化时间，增加血小板功能，提高凝血酶形成的效率。所有冷沉淀的输注在复杂的心脏手术与高危主动脉修复手术中，可以有效起到提高凝血功能的恢复，减少术后出血，大大缩短创面愈合的时间。

在中重度烧伤患者中应用烧伤后由于病情发展迅速，患者会伴有弥散性血管内凝血（DIC），在患者实施抢救的同时，及时输注适量的冷沉淀不仅可以有效阻止DIC的发展，而且可以有效促进凝血机制的恢复。当患者在后期发生严重感染，消耗血浆中大量的Fn，机体吞噬细胞的防御功能会大大降低，异物的清除功能明显下降，在输注适量的冷沉淀后患者的血浆中Fn的水平会明显提高，冷沉淀的输注半小时后表现最为明显，2 h后Fn的浓度会保持相对稳定的高水平状态。

3.3.2 在内、儿科中的应用

冷沉淀凝血因子在血液内科主要用于儿童及成人轻型血友病甲、血管性血友病、先天性以及获得性纤维蛋白原缺乏症患者的治疗。而且其可以做为血友病甲治疗的主要手段。血管性血友病患者的血浆中除了缺乏FⅧ，而且VwF的量和（或）质等方面均有异常的表现，临床主要是以皮肤出血，鼻腔出血，若是妇女则会出现月经过多，用一般的的止血方法效果并不是很好。在冷沉淀中含有相对较高浓度的VwF，因此输注适量的冷沉淀会有止血的效果。先天性凝血因子障碍的患者，出现显著纤维蛋白缺乏时，可以使用冷沉淀治疗代替冻干的纤维蛋白原治疗。先天性FⅩⅢ缺乏可用冷沉淀补充，提高FⅩⅢ水平。

对于甲型血友病患者，按每单位冷沉淀凝血因子含FⅧ 100 IU计算，轻度的出血患者及时施与10～15 IU／kg体重，中度的出血患者者可施与20～30 IU／kg，重度出血患者者可以增加到40～50 IU／kg的用药量。对于循环系统出现超负荷的患者可以改用Ⅷ因子浓缩剂进行治疗。血管性血友病与甲型血友病相比患者的病情差异比较大，给患者的药剂用量很难有标准的用量范围，血管性血友病患者的治疗过程用量可以为每1袋/5 kg体重，1次/d，持续3～4天，观察患者者出现迟发性的出血时，可以增加到7～10天。特别注意的是血小板型的血管性血友病患者使用冷沉淀没有任何效果，需要输注血小板来进行治疗。接受治疗的患者所需冷沉淀的剂量，一般会取决于其本身血浆中的纤维蛋白原的水平，成人一般正常剂量为16袋/次，当纤维蛋白原水平恢复到0.5～1.0 g／L停止输注。患者由于Ⅷ因子的缺乏而发生出血时，可对患者增加用量到1袋/5kg体重，间隔2～3周一次便可以达止血的目的。

冷沉淀在消化内科主要用于消化道出血、胃炎、十二指肠炎等的治疗。当有消化道大出血时，输入冷沉淀，在其Ⅷ因子作用下，冷沉淀中的纤维结合蛋白的生物胶作用对黏膜病变有明显修复、愈合作用。

3.4 冷淀沉的局部使用

在严重烧伤方面的应用，冷沉淀中纤维结合蛋白具有很强的生物活性，Fn是非特异性的调理素，可以通过诱导巨噬细胞、成纤维细胞的集聚，增强创面的愈合速度，局部外用冷沉淀，可显著提高烧伤创面Fn的浓度，利于上皮扩展，加速创面的愈合速度，很快控制炎症，减轻或不留瘢痕，恢复迅速等优点。对外科创面，窦道、不易愈合的瘘口，如肛瘘也可局部应用。直接涂于患处可使支气管瘘闭合，增加食管吻合部的强度，显著减少肺组织纤维缝合线间的空气或液体渗漏。口服冷沉淀具有纤维结合蛋白原生物胶的作用，可以明显修复胃与十二指肠粘膜的病变与伤口愈合[16]。粘附结构蛋白在冷沉淀中充当间质，通过相互粘附来发挥上皮细胞的作用，可有效促进伤口创面愈合，其在眼科角膜溃疡的治疗中效果突出。

冷沉淀凝血因子的制备成功，为我市临床用血提供了新的成分品种，保障了凝血因子Ⅷ、凝血因子ⅩⅢ、纤维蛋白原及血管性血友病因子缺乏患者治疗的需要，特别是在ICU、创伤性大出血、产科DIC时治疗时抢救了大量的患者，能广泛用于各级医疗机构和临床科室，其作用性质在不同的角度多种形式参与凝血，显著增强机体创面的愈合，其临床的疗效显著，值得在临床推广应用。

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