土家族药三百棒提取物对大鼠肢体缺血再灌注损伤血清AMPK与VEGF表达调控的影响*

卢卫忠 周 杰姜仁建 刘正敏 胡志芬 曹洪辉 刘金坤 王 琴

（重庆市中医院，重庆 400021）

·研究报告·

土家族药三百棒提取物对大鼠肢体缺血再灌注损伤血清AMPK与VEGF表达调控的影响*

卢卫忠 周 杰△姜仁建 刘正敏 胡志芬 曹洪辉 刘金坤 王 琴

（重庆市中医院，重庆 400021）

目的 观察三百棒提取物对大鼠肢体缺血再灌注损伤血清腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）与血管内皮生长因子（VEGF）表达调控的影响。方法 将66只SD大鼠随机分为对照组、缺血-再灌注组（IR组）和三百棒提取物干预组（T-IR组）。IR组30只，再分为再灌注后0 h、2 h、4 h、8 h、16 h组，各6只；T-IR组30只，再分为再灌注后0 h、2 h、4 h、8 h、16 h组，各6只；对照组6只。对照组不给药物，IR组于缺血前12 h、缺血时和再灌注时各给予1 mL 0.9%氯化钠注射液灌胃；三百棒提取物干预组于缺血前12 h、缺血时和再灌注时各给予1 mL三百棒提取物灌胃，分别于相应时间点在麻醉下抽取各组动物下腔静脉血，测量血清中AMPK和VEGF的含量。结果 与对照组比较，IR组和T-IR组在再灌注后2 h、4 h、8 h、16 h大鼠血清AMPK水平均明显下降（均P＜0.05）。与IR组各同期比较，T-IR组大鼠血清AMPK水平均明显上升（均P＜0.05）。与对照组比较，IR组和三百棒提取物干预T-IR组在再灌注后4 h、8 h、16 h大鼠血清VEGF水平明显升高 （均P＜0.05）。与IR组各同期比较，T-IR组大鼠血清VEGF水平均明显上升（均P＜0.05）。结论 三百棒提取物能增加大鼠肢体缺血再灌注损伤血清AMPK与VEGF表达，对大鼠肢体缺血再灌注损伤具有保护作用。

缺血再灌注损伤 三百棒 提取物 肢体 AMPK VEGF

缺血再灌注损伤（I/R）指器官在缺血基础上恢复血流后，组织器官损伤反而加重的现象，广泛存在于机体各组织器官中［1］。临床骨科肢体I/R主要由创伤、止血带应用时间过长、血管栓塞、断肢（指）体再植等引起，表现为组织肿胀、疼痛，出现组织坏死，继发远离损伤部位的组织器官损伤，引起患者局部和全身严重反应而导致手术失败，发生率高达10%～20%，若处理不当约1%可危及患者生命［2-3］。如何有效防治肢体I/R，减轻肢体损伤程度，最大限度恢复肢体功能是临床医生研究的方向。Dmitry和Khan等研究发现，肢体缺血再灌注损伤严重程度及临床转归与血清腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和血管内皮生长因子（VEGF）表达直接相关［4-5］，提高血清及病变组织中AMPK和VEGF的浓度，可明显减轻肢体I/R，促进创伤修复。中医药研究资源丰富，土家族药三百棒作为土家族治疗软组织损伤、骨折的传统药物，其疗效显著、历史悠久。既往研究表明其具有改善循环［6］、抗炎镇痛［7］的作用，能明显减轻肢体I/R，但其作用机制不明确。本研究将三百棒提取物用于大鼠肢体缺血再灌注损伤模型，观察其对大鼠肢体I/R后血清AMPK和VEGF的影响，探讨其保护作用及规律，为临床应用三百棒提取物防治肢体I/R提供理论基础和新策略。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由重庆医科大学实验动物中心提供66只SPF级健康雄性SD大鼠，体质量（250±50）g，批号SYXK（渝）2016-0001。

1.2 三百棒提取物制作 参照文献［8］方法，在重庆市中医院中药制剂制作三百棒提取物，按1∶20（g/mL）料液比，在10 kg三百棒原药中加入适量蒸馏水，煎煮20 min，去渣，70℃下浓缩3000 mL煎煮液，得粉末状提取物，共0.5 kg，装瓶备用。

1.3 试剂与仪器 AMPK测定试剂盒和VEGF测定试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；10%水合氯醛购自中南大学湘雅二医院制药厂；无水乙醇（分析纯）购自湖南师范大学化学试剂厂；蒸馏水、旋涡混匀器、低温冰箱、离心沉淀器、微量式移液器（200 μL，1 mL）、普通手术器械等常规试剂和仪器由重庆市中医院动物实验室提供。

1.4 分组与造模 66只大鼠按随机数字表法分为缺血-再灌注组（IR组）、三百棒提取物干预组（T-IR组）和对照组。IR组30只，再分为再灌注后0 h、2 h、4 h、8 h、16 h组，各6只；T-IR组30只，再分为再灌注后0 h、2 h、4 h、8 h、16 h组，各6只；对照组6只。参照文献［9-10］方法制作SD大鼠后肢缺血-再灌注模型。大鼠麻醉成功后，将缠绕了橡皮筋的塑料管（直径2～3 cm）套入大鼠右后肢，尽量推向大腿根部，将橡皮筋从管上退下在大腿根部，通过橡皮筋回缩力，将后肢根部环扎，压迫股动脉阻断后肢的血流，大鼠足趾苍白、温度下降，即为后肢缺血状，而非青紫淤血。大鼠后肢缺血4 h后，剪断橡皮筋，轻揉环扎处，恢复血流，此时大鼠足趾渐渐转为红润，即为后肢再灌注状。对照组用橡皮筋松弛环绕大鼠右后肢，不阻断血流。

1.5 给药方法［9-10］将粉末状三百棒提取物采用1∶1与蒸馏水混合后灌胃。T-IR组大鼠在缺血前12 h、缺血时和再灌注开始时各给予l mL三百棒提取物灌胃；IR组在缺血前12 h、缺血时和再灌注开始时各给予1 mL 0.9%氯化钠注射液灌胃。对照组不给药。

1.6 标本采集 各组动物在相应时间点行水合氯醛（5 mg/kg）腹腔内注射麻醉，麻醉成功后仰卧位固定于鼠手术台。去掉腹部切口区域毛发，络合碘消毒后，沿腹部中线切开，显露下腔静脉，穿刺抽出静脉血，分离血清放低温冰箱备用。

1.7 观察指标 严格按照产品使用说明书的操作方法，测量各组动物不同相应时间点内血清AMPK及VEGF含量。

1.8 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，采用t检验；重复测量计量资料用重复测量资料方差分析。计数资料以比例（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清AMPK水平比较 见表1。结果示，与对照组比较，IR组和T-IR组在再灌注后2 h、4 h、8 h、16 h大鼠血清AMPK水平均明显下降（均P＜0.05）。与IR组各同期比较，T-IR组大鼠血清AMPK水平均明显上升（均P＜0.05）。

表1 各组大鼠血清AMPK水平比较（ng/mL，±s）

表1 各组大鼠血清AMPK水平比较（ng/mL，±s）

与对照组同期比较，*P＜0.05；与IR组同期比较，△P＜0.05。下同。

组别n 0 h 2 h 4 h 8 h 16 h对照组 6 IR组 6 10.87±0.62 10.87±0.62 10.87±0.62 9.81±0.61 3.87±0.48*3.92±0.46*10.87±0.62 10.87±0.62 4.20±0.39*4.52±0.51*T-IR组 69.87±0.54 5.88±0.46*△5.92±0.38*△6.80±0.56*△8.36±0.42*△

2.2 各组大鼠血清VEGF水平比较 见表2。与对照组比较，IR组和T-IR组在再灌注后4 h、8 h、16 h大鼠血清VEGF水平明显升高（均P＜0.05）。与IR组各同期比较，T-IR组大鼠血清VEGF水平均明显上升（均P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清中VEGF水平比较（pg/mL，±s）

表2 各组大鼠血清中VEGF水平比较（pg/mL，±s）

组别 n 0 h 2 h 4 h 8 h 16 h对照组 6 IR组 6 28.87±0.62 28.87±0.62 28.87±0.62 28.81±0.61 30.87±0.48 31.92±0.46*28.87±0.62 28.87±0.62 46.20±0.39*44.52±0.51*T-IR组 629.87±0.54 31.88±0.46 32.92±0.38*△60.80±0.56*△68.36±0.42*△

3 讨 论

肢体I/R主要见于使用止血带、断肢（指）再植、游离组织瓣移植等，常导致肢体和移植组织循环失调使手术失败，严重时危及患者生命。最大程度降低缺血再灌注对肢体的损伤，是临床医生追求的方向。近年来，人们开展了大量的研究工作，有各种保护措施［11-12］，但缺血保护作用有限。中国传统医药研究资源丰富，土家族药三百棒，又名飞龙掌血，为芸香科植物飞龙掌血的根，具有散瘀、止血等功效。现代研究发现三百棒具有抗凝、扩血管、改善毛细血管通透性、镇痛等作用［13-14］，但其作用机制尚不清楚。

研究表明，缺血组织再灌注时造成的微血管和实质器官损伤与病变组织中AMPK［15］和VEGF［16］相关。AMPK是细胞内能量的开关［17］，其活性主要受细胞内AMP/ATP比值和肌酸/磷酸肌酸比值升高的调节。在生理情况下细胞中维持着高浓度的ATP水平，变化范围很小。当肢体发生I/R时，组织严重缺氧，ATP含量迅速减少，AMP/ATP比值增加，AMPK被激活［7］，其表达增强。在肢体缺血再灌注损伤中，血管内皮细胞也会发生形态及功能剧变，血管完整性消失，内皮组织暴露，血管壁通透性增高，微血管循环功能出现障碍，缺氧可诱导低氧诱导因子（HIF）产生，在HIF介导下，VEGF mRNA转录和稳定性增加［18］，VEGF受体表达上调，VEGF生物学效应剧增［19］。随着低氧条件改善，AMPK及VEGF水平可逆地下降。因此，AMPK及VEGF通路的表达可快速反映各种治疗手段对防治肢体I/R的有效性。AMPK和VEGF在改善血管通透性及血管新生过程中起着重要作用［20］，对肢体缺血再灌注损伤修复有着重要意义。

本研究从“瘀”入手，以“散瘀”为中医治疗思路，将三百棒提取物用于防治大鼠肢体I/R，观察其对大鼠肢体I/R后血清AMPK和VEGF的影响。结果表明，给予三百棒提取物作用后，大鼠肢体I/R后血清AMPK和VEGF水平明显升高，随着再灌注时间延长，血清AMPK和VEGF水平升高越明显。本研究提示三百棒提取物可增加AMPK信号通路的表达，有利于细胞线粒体适应缺氧状态，提高能量转化与供应；同时通过增强VEGF信号通路的表达，有助于血管内皮细胞增殖、迁移，促进毛细血管再生、组织侧支循环建立，从而改善供血，促进损伤后组织功能恢复，对大鼠肢体缺血再灌注损伤起到明显的保护作用。

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Effect of Tujia Medicine Toddalia Asiatic Extract on AMPK and VEGF Expressionin Rats with Ischemic-Reperfusion Injury

LU Weizhong，ZHOU Jie，JIANG Renjian，et al. Traditional Chinese Medical Hospital of Chongqing，Chongqing 400021，China.

Objective：To investigate the effect of Tujia medicine Toddalia asiatica extract on AMPK and VEGF expression in rats with ischemic-reperfusion injury.Methods：66 SD rats were randomly divided into control group，ischemia-reperfusion group and Toddalia asiatic extract intervention group.The control group animals were not given any drug；the ischemia-reperfusion group rats were gavaged with 1 mL of 0.9%NS in the first 12 h prior to ischemia，ischemia and reperfusion；the Toddalia asiatic extract intervention group rats were given 1 mL of Toddalia asiatic extracts in the first 12 h prior to ischemia，ischemia and reperfusion.Inferior vena venous blood was extracted respectivelyfrom each group animals at corresponding time points under anesthesia，the contents of serum AMPK and VEGF were measured.Results：Compared with the ischemia-reperfusion group，AMPK and VEGF content in serum of rats increased significantly in theToddalia asiatic extract intervention group at each time point（P＜0.05）.The highestmeasured value appeared in 16 hours after reperfusion.Conclusion：Toddalia asiatic extract can increase serum AMPK and VEGF expression in rats with limb ischemia reperfusion injury，and has a protective effect on rat limb ischemia reperfusion injury.

Extract；Toddalia asiatic；Ischemic-reperfusion injury；Limbs；AMPK；VEGF

R285.5

A

1004-745X（2017）04-0608-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.04.013

2017-03-17）

重庆市科委科研院所基本科研业务费计划项目（cstc2015jbky330025007）

△通信作者（电子邮箱：13983905720@163.com）