青藤碱对BALB/c-nu/nu裸小鼠高侵袭性人结肠癌SW 480移植瘤增殖及环氧合酶-2表达的影响*

朱红玲王秋荣何华琼

（1.湖北省十堰市太和医院 湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院，湖北 十堰 442000）

·研究报告·

青藤碱对BALB/c-nu/nu裸小鼠高侵袭性人结肠癌SW 480移植瘤增殖及环氧合酶-2表达的影响*

朱红玲1王秋荣1何华琼2△

（1.湖北省十堰市太和医院 湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院，湖北 十堰 442000）

目的 观察青藤碱对高侵袭性人结肠癌细胞株SW 480移植瘤细胞周期及结肠瘤体组织中环氧合酶-2（COX-2）表达的影响，研究青藤碱防治结肠癌的机制。方法 先用5只免疫功能正常的BALB／c-nu/nu裸小鼠建立高侵袭性人结肠癌瘤源，3周后取直径约2 mm的瘤块移植于20只免疫缺陷的BALB／c-nu/nu2裸小鼠回盲浆膜凹龛部，1周后再随机分为结肠癌组和青藤碱组。青藤碱组按10 mL/（kg·d）灌10%青藤碱治疗30 d，结肠癌组灌0.9%氯化钠注射液对照。测量BALB／c-nu/nu裸小鼠结肠瘤体积、瘤质量并计算肿瘤抑制率；流式细胞仪检测结肠瘤体组织SW 480细胞在G1、G2、M和S期的细胞周期比例；免疫组化法检测结肠瘤体组织COX-2的表达，RT-PCR法检测COX-2 mRNA表达。结果 与结肠癌组比较，青藤碱组结肠瘤体积、瘤质量及S期细胞比值明显降低、G1、G2期细胞比值提高，肿瘤抑制率为（39.75%）（P＜0.05）；COX-2和COX-2 mRNA低表达（P＜0.05）。结论 青藤碱可能在G1、G2和S期诱导 SW 480细胞阻滞、抑制结肠癌细胞株SW 480细胞的有丝分裂，并通过下调COX-2表达而间接影响癌细胞的增殖，具有抗高侵袭性人结肠癌的作用。

青藤碱 高侵袭性人结肠癌 环氧合酶-2 结肠癌细胞株SW 480 细胞增殖周期

【Key words】Sinomenine；Aggressive human colon cancer；Cyclooxygenase-2；Colon cancer cell line SW 480；Cell cycle

结肠癌具有恶性程度高、高侵袭性和高转移性的特点，在中医学中属 “肠蕈”之范畴，脾胃受损、饮食失节及湿热壅聚成痰而搏结于肠腑是其主要病因［1-2］。在我国结肠癌发病率仅次于肝癌、肺癌、食管癌和胃癌，其病死率极高，手术切除联合放疗、化疗可降低复发率、提高患者存活时间，其预后与肿瘤细胞浸润转移密切相关［3］。研究表明，环氧合酶（COX-2）在结肠组织中表达与结肠癌细胞株SW 480细胞的增殖、分化有关，通过干扰结肠癌细胞株SW 480细胞的有丝分裂，抑制肿瘤细胞分裂增殖中的相关的酶（COX-2）的表达可影响肿瘤细胞的分化与增殖［4-5］。本研究主要观察青藤碱对高侵袭性人结肠癌模型BALB／c-nu/nu裸小鼠结肠瘤体组织中COX-2表达和结肠癌细胞株SW 480生长增殖的相关性，研究青藤碱防治结肠癌的机制，为临床治疗提供依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验用BALB／c-nu/nu裸小鼠为SPF级，25只，雌性，体质量（22±3）g，鼠龄4～5周；实验动物生产许可证（SCXK（鄂）2013-0008），本实验在湖北医药学院动物房标准实验室完成 ［SYXK（鄂）2013-0031］。

1.2 试剂与器材 高侵袭性人结肠癌SW 480细胞株（由十堰市太和医院消化内科提供，人结肠癌组织来源于2016年1月2日的1名手术患者，男性，乳头状管状腺癌Ⅱ级）；青藤碱（烟台鲁银药业有限公司，批号H01601217）；水合氯醛（采购自无锡市亚泰联合化工有限公司，批号160220）；鼠COX-2 ELISA试剂盒用其AMV逆转录酶 （采购自上海双赢生物科技有限公司，批号96T/48T，160317）；流式细胞仪（Epics Altra，美国贝克曼库尔特公司）。

1.3 造模 1）高侵袭性人结肠癌模型（瘤源）制备。将十堰市太和医院消化内科手术时切取的新鲜人结肠癌组织标本置于含0.1%庆大霉素生理盐水浸泡2 min后切取淡红色、生长良好的鱼肉状瘤组织，剪成直径2 mm的瘤块，然后用20号套管针将肿瘤组织分别注射移植到5只免疫功能正常的BALB／c-nu/nu裸小鼠左侧背部皮下，压迫止血。术后单笼饲养，定时观察移植瘤的生长情况，待瘤体直径达到10 mm时（3周时），处死裸小鼠，取瘤组织再次按以上述方法皮下移植，经3代传代后就可建立稳定的后皮下移植瘤动物模型。2）高侵袭性人结肠癌原位移植瘤模型制备。用以上高侵袭性人结肠癌模型裸小鼠为瘤源，处死瘤源动物后，取肿瘤组织，置于含0.1%庆大霉素的0.9%氯化钠注射液中浸泡清洗2 min，再次切取鱼肉状瘤组织，剪成直径2 mm的瘤块备用。取20只免疫缺陷的BALB／c-nu/nu裸小鼠，用10%水合氯醛麻醉（按0.25 mL/100 g剂量麻醉）动物，待动物麻醉后，仰卧位固定，用75%酒精消毒腹部皮肤。在盲肠部位打开腹腔并寻找盲肠，小心钳出小鼠盲肠，在盲肠末端划破浆膜面，将备用的瘤块塞入回盲浆膜凹龛部，然后回纳盲肠入腹腔，用可吸收线分层缝合腹腔，消毒，放入鼠笼单笼饲养［6］。术后观察小鼠腹部体征。

1．4 分组与给药 原位移植瘤模型制备手术后1周，将存活BALB／c-nu/nu裸小鼠随机分为结肠癌组和青藤碱组。治疗前将青藤碱配制成10%的水溶液，治疗时按《药理学实验》中动物给药方法，将鼠体表面积换算成青藤碱用量 ［换算后鼠用量为10 mL/（kg·d）］灌胃治疗30 d，结肠癌组灌0.9%氯化钠注射液对照。

1.5 检测指标 1）SW 480移植瘤细胞周期用抑瘤率检测。参照文献［7］，在治疗30 d，用游标卡尺准确测量瘤体长、短径3次，取平均值减少误差，然后计算肿瘤体积（肿瘤体积＝ax6／2，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径）。处死动物，完整地取出肿瘤组织，称质量，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率（%）＝［（结肠癌组平均瘤重-青藤碱组平均瘤质量）/结肠癌组平均瘤质量×100%］。参照文献［8］，采用美国Epics Altra流式细胞仪检测结肠瘤体组织SW 480细胞在G1、G2、M和S期的增殖周期比例。2）实时定量PCR分析COX-2和COX-2 mRNA的表达。参照文献［9］，取瘤体组织50 mg，一步法提取瘤体组织总RNA，取1 μg总RNA，用AMV逆转录酶进行逆转录；引物序列见表1，PCR反应体系：反转录产物1 μL、Taq酶 （5 U/μL）0.45 μL、dNTPs（10 mmo1/L each）1 μL、含15 mmol/L Mg缓冲液5 μL，β-actin的上、下游引物各1 μL，COX-2的上、下游引物各1 μL，用灭菌水补充至50 μL。PCR反应条件为：93℃30 s、94℃3 min、64℃30 s、71℃1 min，35个循环，71℃7 min。

表1 引物序列

1.6 统计学处理 应用SPSS15.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析，组间和两样本两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 青藤碱对结肠瘤体组织SW 480细胞在G1、G2、M和S期的增殖周期比例的影响 见表2。青藤碱组G1、G2期细胞增殖比值提高、S期降低，与结肠癌组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 两组结肠瘤体组织SW 480细胞在G1、G2、M和S期的增殖周期比例比较n（%）

2.2 各组瘤质量、瘤体积及抑瘤率比较 见表3。青藤碱组瘤质量和瘤体积均低于结肠癌组，肿瘤抑制率高于结肠癌组（均P＜0.05）。

表3 两组瘤质量、瘤体积及抑瘤率比较

2.3 各组COX-2和COX-2 mRNA表达的比较 见表4。结肠癌组COX-2和COX-2 mRNA在瘤体上均高表达，青藤碱组COX-2和COX-2 mRNA均低表达，与结肠癌组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 两组COX-2和COX-2 mRNA表达的比较（±s）

表4 两组COX-2和COX-2 mRNA表达的比较（±s）

组别 n COX-2（pg/μL） COX-2 mRNA结肠癌组 15 54.82±7.02 33.74±2.91青藤碱组 15 40.62±5.48*20.84±3.05*

3 讨 论

青风藤属防己科植物，药用成份青藤碱是从其根茎中提取的单体生物碱［10］。最新研究表明，该生物碱除具有抗炎、镇痛作用外，还对多种肿瘤细胞的分化增殖有抑制作用，可抑制肝癌、结肠癌、宫颈癌、肺癌及前列腺癌等恶性肿瘤细胞的生长增殖［11］。以往研究多证实青风藤在体外细胞培养中具有肯定的抗癌作用，本实验研究发现其对结肠癌细胞株SW 480移植肿瘤也有一定的抑制作用。

肿瘤的生长和肿瘤细胞分化增殖与其细胞周期的紊乱有密切关系，肿瘤细胞分化和增殖有G1、G2、M和S期4个周期，任何一个环节紊乱均可引起细胞的生长、分化、凋亡失控或异常，并最终导致细胞无限增殖，这就是肿瘤细胞无限制性增殖的原因［12］。在药物治疗时，可选择干扰G1～S期这一细胞周期限制点来实现抗肿瘤目的。有研究证实青藤碱对肝癌Hep G2细胞的生长有明显抑制作用，并诱导肿瘤细胞发生凋亡，诱导细胞G1周期阻滞［13］。也有研究发现青藤碱在体外细胞培养中具有阻滞肿瘤细胞周期的G1期、诱导细胞凋亡的作用，通过这一途经来达到抑制肺癌细胞生长的作用［14］。目前国内对青藤碱干扰高侵袭性人结肠癌细胞株SW 480移植瘤鲜有系统的研究报道。从本研究的结果来看，青藤碱组结肠瘤体积、瘤质量明显降低，肿瘤抑制率达39.75%，这说明青藤碱确有抑制高侵袭性人结肠癌细胞株SW 480移植瘤生长的作用。流式细胞仪检测显示结肠瘤体组织SW 480细胞在G1、G2期细胞比值提高，S期细胞比例降低，这提示青藤碱诱导SW 480移植瘤细胞的G1、G2和S期这一细胞周期限制点，阻滞肿瘤生长。

COX-2与肿瘤的生长和肿瘤细胞分化增殖密切相关，结肠癌中COX-2高表达，这可以作为诊断结肠癌的肿瘤重要标志物之一［15］。COX-2具有过氧化氢酶和环氧化酶活性，可催化花生四烯酸转化为前列腺素而参与机体炎症反应，高表达的COX-2可降解细胞外基膜和基质，促使肿瘤细胞浸润周围组织，增强肿瘤分化和迁移［16-17］。COX-2导致肿瘤分化、迁移及恶化的机制较多，如可能通过上调β-catenin蛋白表达来激活β-catenin信号通路、增加肿瘤VEGF表达来促进肿瘤迁移及恶化［18］。还有研究发现胃癌、结肠癌COX-2高表达，这会降低介导细胞间黏附的 E-cadherin的活性，提高肿瘤细胞与细胞外基质蛋白黏附能力而增加肿瘤细胞的侵袭力［19］。在本实验中，青藤碱组COX-2和COX-2 mRNA低表达，这提示青藤碱还可通过影响COX-2蛋白合成来抑制SW 480移植瘤细胞生长，但其具体是能过什么途经还有待进一步的研究。

综上所述，在高侵袭性人结肠癌细胞株SW 480移植瘤结肠肿瘤组织中，S期细胞比值降低，G1、G2期细胞比值提高，且COX-2和COX-2 mRNA低表达。青藤碱可能在G1、G2和S期诱导SW 480细胞阻滞、抑制结肠癌细胞株SW 480细胞的有丝分裂，并通过下调COX-2表达而间接影响癌细胞的增殖，提示G1、G2和S期阻滞与影响COX-2表达可能是高侵袭性结肠癌治疗的新靶点。

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Effect of Sinomenine on BALB/c-nu/nu Nude Mice of Highly Invasive Human Colon Cancer SW Cell Proliferation and Tumor 480 Epoxy Synthase-2 Expression

ZHU Hongling，WANG Qiurong，HE Huaqiong.Taihe Hospital，the Affiliated Hospital of Hubei Medical University，Hubei，Shiyan 442000，China.

Objective：To observe the effect of sinomenine on invasion of human colon cancer cell line SW 480 tumor cell cycle and colon tumor cyclooxygenase-2（cyclooxygenase-2，COX-2）expression and mechanism of treating colon cancer with sinomenine.Methods：5 immunocompetent BALB/c-nu/nu mice were used to establish highly invasive human colon tumor models，3 weeks later，tumor block which had a diameter of 2 mm was transplanted to 20 immunodeficient BALB/c-nu/nu nude mice ileocecal serous concave niche，1 week later，they were randomly divided into colon cancer group and sinomenine group.Sinomenine group was treated by 10 mL/（kg·d）with 10%sinomenine for 30 days（d），colon cancer group was given saline control.The measurement of BALB/ c-nu/nu nude mice colon tumor volume，tumor weight and tumor inhibition rate was calculated；the colon tumor tissue SW was detected by flow cytometry in 480 cells in the cell cycle of G1，G2，M and S phase ratio；immunohistochemistry was used to detect the expression of colon tumor tissue COX-2，COX-2 mRNA expression was detected by RT-PCR.Results：Compared with colon cancer group，sinomenine group colon tumor volume，tumor cell ratio and quality of S stage decreased，G1and G2phase cells ratio increased，tumor inhibition rate was （39.75%）（P＜0.05）；the expression of COX-2 and COX-2 mRNA was low（P＜0.05），the differences were statistically significant.Conclusion：Sinomenine can inhibit colon cancer SW 480 cells induced by SW 480 cell block in G1，G2and S phase of mitosis，and through down-regulation of COX-2 expression，it indirectly influences the proliferation of cancer cells with high invasive human colon cancer.

R285.5

A

1004-745X（2017）04-0591-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.04.008

2017-01-03）

湖北省教育指导项目（B2016125）

△通信作者（电子邮箱：job13872797666@163.com）