IL-17A、TNF-α在哮喘小鼠模型气道炎症中的变化及射干麻黄汤的干预作用研究*

隋博文李明爽王 达许湘源翟平平李明虎王 浩

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

·研究报告·

IL-17A、TNF-α在哮喘小鼠模型气道炎症中的变化及射干麻黄汤的干预作用研究*

隋博文1李明爽2王 达2许湘源1翟平平2李明虎2王 浩2

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

目的 观察细胞因子白介素-17A（IL-17A）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在慢性哮喘小鼠模型气道炎症中的变化及射干麻黄汤的干预作用。方法 60只Balb/c小鼠小鼠随机分为模型组（A组）、中药汤剂组（B组）、对照组（C组）、地塞米松组（D组）4组。采用卵蛋白（OVA）、氢氧化铝联合雾化吸入的方法建立慢性哮喘小鼠模型，并通过不同方式对各组进行干预。取离心后的支气管肺泡灌洗液（BALF）中沉渣计细胞总数及细胞分类计数，取上清液以酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测细胞因子IL-17A、TNF-α的含量。观察IL-17A、TNF-α在慢性哮喘小鼠模型气道炎症中的变化及射干麻黄汤的干预作用。结果 与C组相比，A、B、D组小鼠在实验期间均出现被毛凌乱、少光泽、活动及进食减少、反应迟钝等表现，在雾化激发时均出现不同程度的躁动、骚鼻、呼吸急促、点头样呼吸、口唇青紫等症状，其中B、D组上述症状明显较A组轻。实验过程中A、D组小鼠各死亡1例，B、C组无死亡。与C组比较，A组BALF中细胞总数及NEU、EOS、LYM百分率均显著增多（均P＜0.01）；与A组比较，B、D组细胞数及NEU、EOS、LYM百分率均降低（均P＜0.05）。D组与B组比较差别不大P＞0.05）。与C组比较，A组细胞因子IL-17A、TNF-α含量增高（P＜0.05）。与A组比较，B、D组细胞因子IL-17A、TNF-α含量均减少（均P＜0.05）；D组与B组比较差别不大（P＞0.05）。提示细胞因子IL-17、TNF-α在介导哮喘气道炎症反应中发挥重要作用。IL-17A、TNF-α与气道炎症均呈显著正相关（P＜0.05）。结论 射干麻黄汤可能通过下调细胞因子IL-17A、TNF-α来抑制炎症细胞在哮喘小鼠气道内的聚集，从而减轻气道炎症。

哮喘 IL-17A TNF-α 气道炎症 射干麻黄汤

支气管哮喘简称哮喘，是由多种炎症细胞（嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病［1］。近些年随着大气环境、饮食结构、社会环境等因素的改变，哮喘发病率呈逐年上升趋势［2］。细胞因子白介素-17A（IL-17A）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为哮喘气道炎症的重要参与因子成为研究热点。IL-17A是一种由Th17等多种效应细胞产生的细胞因子，可通过各种不同方式调节微环境中细胞因子、趋化因子、黏附性分子等表达，募集炎症细胞特别是中性粒细胞而发挥炎症效应，参与炎症性疾病［3］。TNF-α主要由单核巨噬细胞产生，适当水平的TNF-α有利于组织修复、炎症应答，而高水平的TNF-α却能使局部血管的通透性增强，从而促进支气管活性物质释放［4］。临床研究表明［5-6］，射干麻黄汤能够改善哮喘症状，减轻气道炎症细胞聚集，但其具体作用机制尚未完全清楚。本研究通过观察射干麻黄汤干预哮喘模型小鼠后，观察其IL-17A、TNF-α及各项炎症指标的变化，初步探讨射干麻黄汤治疗哮喘的作用及机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Balb/c小鼠，雄性，体质量（20±2）g，共60只，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供［生产许可证号SCXK（黑）2013-004］，以小鼠专用饲料及饮用水喂养。按照随机数字表法随机分为模型组（A组）、中药汤剂组（B组）、对照组（C组）、地塞米松组（D组）4组，每组15只。

1.2 药物与试剂 射干麻黄汤（射干9 g，麻黄12 g，法半夏12 g，紫菀9 g，款冬花9 g，大枣12 g，细辛3 g，生姜12 g，五味子12 g）由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室提供。地塞米松针剂（5 mg/1 mL）由天津天药药业股份有限公司生产。鸡卵清蛋白（OVA，Ⅴ级）：由美国Sigma公司生产。小鼠IL-17、TNF-α ELISA试剂盒，由美国R＆D公司生产。氢氧化钠，由天津市巴斯夫化工有限公司生产。

1.3 仪器 超声雾化吸入器BSW-2A，鞍山贝尔思科技有限公司生产；玻璃雾化箱（60 cm×50 cm×40 cm），自制；低温高速离心机XR-22，美国BECKMAN COULTER公司；电热恒温干燥箱202-0A型，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.4 造模及药物干预 依据乔明等人的方案［7］利用OVA被动致敏并激发的方法建立哮喘小鼠模型。A、B、D组分别在实验第1日和实验第14日经腹腔注射0.2 mL致敏混悬液 （含20 μg OVA和100 μg氢氧化铝）致敏，C组经腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液。第21日起，A、B、D组小鼠放于玻璃雾化箱中给予2.5%OVA混悬液雾化激发，每次约30 min，隔日1次，C组给予等量0.9%氯化钠注射液雾化。B组在每次雾化前给予射干麻黄汤（4.1 g/mL）灌胃，射干麻黄汤药物剂量根据陈奇等［8］关于药物剂量计算公式推算出，A、C组以等量0.9%氯化钠注射液代替。共雾化8周。

1.5 支气管肺泡灌洗液（BALF）收集与指标检测 各组小鼠最后一次雾化后24 h内，以4%水合氯醛麻醉小鼠，打开胸腔，在左主支气管处结扎左肺，以冰磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌洗右肺，反复共3次，每次入量为0.3 mL，灌洗时可适当按摩胸部，以便灌洗充分。每只小鼠BALF回收率大于80%为合格标本。计细胞总数，离心，沉淀重悬涂片，染色，行炎症细胞分类［中性粒细胞（NEU）、嗜酸性粒细胞（EOS）、淋巴细胞（LYM）］计数。BALF中的上清液用ELISA法检测IL-17A及TNF-α水平，操作方法严格按照ELISA试剂盒说明书上进行。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件处理。数据资料以（±s）来表示，组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠哮喘发作行为特点 与C组相比，A、B、D组小鼠在实验期间均出现被毛凌乱、少光泽、活动及进食减少、反应迟钝等表现，在雾化激发时均出现不同程度的躁动、骚鼻、呼吸急促、点头样呼吸、口唇青紫等症状，其中B、D组上述症状明显较A组轻。实验过程中A、D组小鼠各死亡1例，B、C组无死亡。

2.2 各组小鼠气道炎症细胞参数比较 见表1。结果示，与C组比较，A组BALF中细胞总数及NEU、EOS、LYM百分率均显著增多（均P＜0.01）。与A组比较，B、D组细胞数及NEU、EOS、LYM百分率均降低 （均P＜0.05）。D组与B组比较差别不大（P＞0.05）。

2.3 各组小鼠IL-17A、TNF-α含量比较 见表2。与C组比较，A组细胞因子IL-17A、TNF-α含量增高（P＜0.05）。与A组比较，B、D组细胞因子IL-17A、TNF-α含量均减少（均P＜0.05）。D组与B组比较差别不大（P＞0.05）。

2.4 射干麻黄汤组IL-17A、TNF-α与气道炎症相关性分析 见表3。结果示，IL-17A、TNF-α与气道炎症均呈显著正相关（P＜0.05）。

表1 各组小鼠BALF中炎症细胞的数量（×105/L，，±s）

表1 各组小鼠BALF中炎症细胞的数量（×105/L，，±s）

与A组比较，*P＜0.05；与C组比较，△P＜0.01。下同。

组别 n 细胞总数 NEU EOS IYM A组 14 B组 15 C组 15 4.55±0.26△27.97±9.62△35.65±7.58△38.14±2.43△1.63±0.22*10.26±1.80*12.26±2.54*11.14±4.29*0.88±0.35 9.01±1.34 4.95±3.11 2.24±8.41 D组 141.59±0.32 10.11±1.02 11.08±1.89 13.25±2.46

表2 各组小鼠BALF中细胞因子IL-17 A、TNF-α含量比较（±s）

表2 各组小鼠BALF中细胞因子IL-17 A、TNF-α含量比较（±s）

组 别 n IL-17A（pg/mL） TNF-α（μg/L）A组 14 293.73±20.20△2.68±0.03△B组 15 237.66±32.49*1.85±0.11*C组 15 220.32±19.22 1.15±0.08 D组 14 240.13±13.56 1.81±0.34

表3 射干麻黄汤组IL-17A、TNF-α与气道炎症相关性分析

3 讨 论

气道炎症是哮喘发作期的主要病理特征之一，IL-17A作为Th17细胞的重要效应因子，通过与大量1L-17A受体结合，在促炎反应中发挥巨大作用。研究发现［9］1L-17A能通过诱导细胞分泌、释放多种中性粒细胞趋化因子（1L-6、1L-8、粒细胞集落刺激因子、前列腺素等）及通过加速中性粒细胞发育成熟速度来诱导炎症反应［10］。吴红梅等通过研究发现，哮喘发作期患者血清1L-17A明显升高［11］。TNF-α是哮喘气道中的前炎性细胞因子，又是哮喘炎症过程中重要启动因子，可以刺激气道引起IL-8、GM-CSF等分泌增加而加重气道炎症，并协同IL-4合成IgE促使哮喘发作［12］，其又能够增强呼吸道血管内皮细胞表面黏附分子的表达，炎性细胞等包括中性粒细胞等黏附于血管内皮细胞，再从血循环渗入气道黏膜组织，致使黏附分子异常表达，气道炎症反应发生［13］。大量研究提示，无论何种类型的哮喘皆有TNF-α异常高表达［14］。以上实验及临床观察均表明1L-17A、TNF-α起到了聚集炎症细胞的作用，二者的异常高表达可促进气道炎症发生。

支气管哮喘属于中医学“哮病”范畴，本因宿有伏痰，每因感受外邪或内伤七情而发［15］。射干麻黄汤出自《金匮要略》，是治疗哮证（冷哮）的经典方剂。方中麻黄、细辛、生姜、款冬花均能宣肺化饮，其中麻黄重于宣发，细辛重于化饮，生姜重于宣透，款冬花重于宣散；法半夏、射干、紫菀降肺化饮，法半夏又可醒脾燥湿，射干兼能利肺消痰，紫菀长于下气消痰；五味子敛肺益气；大枣益气和中，调和诸药。方中各药相互为用，达“温肺化饮，下气祛痰”之效［16］。西医药理学研究证实，射干麻黄汤主要通过降低痰液黏稠度，增加呼吸道纤毛运动幅度，促进气道分泌物排出来发挥其祛痰、平喘、抗炎的治疗作用［17］，同时还能减少哮喘豚鼠发作频率，减轻发作程度，减少小鼠肺内炎症物质渗出［18］。王永胜在临床观察中，发现射干麻黄汤在改善患者胸闷、气短、咳嗽、咯痰、喘息症状等方面效果显著，且能减少肺部病理性杂音［19］，表明射干麻黄汤的确能通过能减轻气道炎症，进而改善哮喘患者（或小鼠）哮喘症状。朱璐卡等通过观察射干麻黄汤治疗后的支气管哮喘患儿，发现患儿血清中TNF-α皆有降低，因此认为射干麻黄汤能通过降低TNF-α来治疗哮喘［20］。曹珲的研究也进一步验证了射干麻黄汤减轻气道炎症是通过降低IL-17A、TNF-α水平来实现的［1］。

本实验结果示，哮喘组小鼠BALF中细胞总数和NEU、EOS、LYM均明显增高，BALF中细胞因子IL-17A、TNF-α的水平较对照组亦明显升高，进一步证实IL-17A、TNF-α确实参与了哮喘的气道炎症过程。经过射干麻黄汤治疗后的小鼠，细胞总数和NEU、EOS、LYM均较模型组明显降低，与地塞米松组差异无统计学意义，表明射干麻黄汤能够抑制气道炎症，并且这种作用可能是通过下调IL-17A、TNF-α来实现的。

综合以上，射干麻黄汤可能通过下调IL-17A、TNF-α来抑制炎症细胞在哮喘小鼠气道内的聚集，从而减轻气道炎症，减轻哮喘小鼠症状。但其具体作用机制仍不够十分明确，有待进一步研究。

［1］ 曹珲.射干麻黄汤对哮喘小鼠气道重塑及TNF-α、IL-17的影响［J］.吉林中医药，2013，33（12）：1258-1260.

［2］ 张建华.支气管哮喘的流行病学及高危因素［J］.实用儿科临床杂志，2008，23（4）：241-243.

［3］ 田宝平，沈华浩.白介素17A及其在支气管哮喘中的作用［J］.中华哮喘杂志，2013，7（5）：350-354.

［4］ 刘静静，谭薇，丁召磊.哮喘小鼠模型肺组织、肺泡灌洗液中1L-17A及TNF-α水平比较［J］.潍坊医学院学报，2014，32（2）：120-122.

［5］ 陈照南，陈昭玲.加减射干麻黄汤治疗支气管哮喘29例临床研究［J］.内蒙古中医药.2014，16（127）：4.

［6］ 朱金鑫.射干麻黄汤治疗难治性哮喘患者 98例疗效观察［J］.临床合理用药，2014，7（6）：47-48.

［7］ 乔明，刘兰英，王和生.支气管哮喘慢性气道炎症小鼠模型的建立与评价［J］.辽宁中医杂志2014，41（6）：1084-1086.

［8］ 陈奇，孙瑞元，邓文龙，等.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1993：33-34.

［9］ 凌昊，赵霞.Th17细胞及相关细胞因子在哮喘中的作用研究［J］.长春中医药大学学报，2014，30（5）：931.

［10］龚雨新，于化鹏.白细胞介素17A在哮喘发病机制中的研究进展［J］.中国呼吸与危重监护杂志，2009，8（2）：199-201.

［11］吴红梅.血清IL-17在支气管哮喘患儿中的表达意义［J］.中国医药指南，2014，12（23）：49-50.

［12］朱璞玉，曹勇.射干麻黄汤治疗肺系疾病的理论及文献研究［D］.广州：暨南大学，2014.

［13］莫碧文，张珍祥，徐永健，等.核因子-κB对TNF-α诱导的小鼠气道平滑肌细胞增殖、凋亡及TGF-β1表达的影响［J］.中国病理生理杂志，2007，23（9）：1767-1771.

［14］姚俊，赵霞.中医药治疗哮喘对TNF-α影响的研究进展［J］.吉林中医药，2014，41（9）：2010.

［15］李竹英.支气管哮喘中西医结合诊断治疗学［M］.哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，2012：12-14.

［16］王付.用射干麻黄汤方证的思考与探索［J］.中医药通报，2013，12（4）：117.

［17］赵丽芸，单丽囡，何建茹.射干麻黄汤对哮喘祛痰作用的动物实验研究［J］.中国中医急症，2011，20（8）：1269．

［18］王芳，王敏.射干麻黄汤治疗哮喘的疗效及机制研究进展［J］.医学研究生学报，2013，26（7）：754-755.

［19］王永胜.射干麻黄汤加味治疗喘证112例［J］.河南中医，2013，33（8）：1214-1215.

［20］朱璐卡，胡国华，王井和，等.射干麻黄汤对小儿咳嗽变异性哮喘的临床疗效及血清IgE、IL4、TNF-α水平的影响［J］.中国中药杂志，2008，33（19）：2265-2266.

Effect of Shegan Mahuang Decoction on Airway Inflammation and IL-17A，TNF-α in Asthmatic MiceModel

SUI Bowen，LI Mingshuang，WANG Da，et al. The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of TCM，Heilongjiang，Haerbin 150040，China.

Objective：To investigate the changes of IL-17A，TNF-α in airway inflammation exacerbation of chronic asthmatic mice model after Shegan Mahuang decoction treatment.Methods：Sixty mice were randomized into four groups：asthma group（group A），Shegan Mahuang decoction group（group B），blank group（group C），and dexamethasone group（group D）.Mice were sensitized and challenged with ovalbumin（OVA），aluminum hydroxide combined with aerosol inhalation to establish the asthmatic models.The mice models of asthma underwent different therapies after models of asthma were established.The changes in cellular proportions in the bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were observed，and the expression of IL-17 and TNF-α in BALF were detected by ELISA. Results：Compared with group C，messy and bleak hair，less movement and eating and slow response were observed during the experiment and during the aerosol inhalation，agitation，nose scratch，polypnea，nodding respiration and cyanotic lips at different degrees were observed in the mice in A，B，D groups.A group was more serious than B and D groups on the symptoms above.There was one death in group A and group D and no death in group B and group C.Compared with group C，The total cell number and the percentages of neutrophils（NEU）eosinophils（EOS）and lymphocytes（LYM）in BALF of the asthmatic mice were significantly higher in group A（P＜0.01），The changes in group B，D were less than group A（all P＜0.05），There was no significant difference between B and D（P＞0.05）.The level of IL-17A，TNF-α in BALF of group A was significantly higher than those ingroup C（P＜0.05），The changes in group B，D were less than group A（all P＜0.05）.There was no significant difference between B and D（P＞0.05）.It showed that IL-17A and TNF-α played an important part in asthma airway inflammation mediation.Conclusion：Shegan Mahuang decoction can regress airway inflammation exacerbation of chronic asthmatic mice model，its mechanism may be achieved through reducing the expression of IL-17A and TNF-α.

Asthma；IL-17A；TNF-α；Airway inflammation；Shegan Mahuang decoction

R285.5

A

1004-745X（2017）04-0581-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.04.005

2017-01-12）

黑龙江省博士后科研启动金项目（LBH-Q13167）