电针内关穴预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO、NOS及腺苷A1受体的影响*

宋 瑾 王 超阳仁达 冯 果 谭成富 刘薇薇 严 洁

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208）

·研究报告·

电针内关穴预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO、NOS及腺苷A1受体的影响*

宋 瑾 王 超△阳仁达 冯 果 谭成富 刘薇薇 严 洁

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208）

目的 观察电针内关预处理对大鼠缺血再灌注损伤心肌的影响，并探讨电针预处理防治心肌缺血再灌注损伤的作用机制。方法 将40只SD雄性大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组（模型组）、电针内关穴组和电针环跳穴组，每组10只。采用冠脉结扎法造模，电针内关组和电针环跳组在造模前，分别给予电针刺激每日20 min，共7 d。记录造模前后心电图Ⅱ导联T波电压值，透射电镜检测心肌病理形态学的变化，采用硝酸还原酶化学比色法检测血清一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）的含量，免疫组化法检测心肌组织腺苷A1受体含量。结果 模型组血清NO含量、NOS活性及腺苷A1受体较假手术组明显下降（P＜0.05或P＜0.01）；电针内关穴组血清NO含量、NOS活性及腺苷A1受体较模型组和电针环跳组明显升高（P＜0.01或P＜0.05）。模型组大鼠与电针环跳穴组大鼠比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 电针内关穴可以有效改善心肌缺血再灌注损伤，对心肌产生保护作用。

心肌缺血再灌注损伤 电针 内关穴 一氧化氮合酶 腺苷A1受体

心肌缺血再灌注损伤是指在较长时间心肌缺血的基础上，心肌血液灌注恢复，缺血与组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性组织损伤的临床现象。中医针灸作为一种传统的治疗方法，也是治疗冠心病的手段之一。本课题组大量的实验及临床研究证明电针内关穴对心肌缺血有明显的改善作用［1-5］。一氧化氮（NO）是人体内信号传导的重要分子，参与神经传导、血管舒张等生理过程，尤其在神经系统中的作用非常重要［6］。一氧化氮合酶（NOS）具有调节NO的生成的作用，是NO生物合成的限速酶。腺苷是一种重要的神经调质，主要分布于神经系统中，主要有4种亚型（A1，A2，A3，A4），对保护组织发挥重要的作用，腺苷的神经调节作用主要是通过腺苷A1受体实现的。本试验选用大鼠心肌缺血再灌注模型，观察电针内关穴对大鼠缺血再灌注心肌中NO、NOS及腺苷A1受体表达的作用，为经脉脏腑相关理论、针刺“治未病”理论以及“胸胁内关谋”理论提供实验数据支撑。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级雄性SD大鼠，体质量250～300 g，共40只，由湖南中医药大学动物实验中心提供（SYXK湘2013-0005，SCXK湘2013-0004）。

1.2 试药与仪器 免疫组化检测腺苷A1受体试剂盒：腺苷A1受体抗体规格1 mL（美国Santacruz公司），图像分析软件为IPP（Image-Pro-Plus），显微镜（MOTIC BA210T）；华佗牌电子针疗仪；汉医牌无菌针灸针（0.25 mm×13 mm，100支/盒）；医用离心机台式高速离心机H1850动（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；数字式心电图机ECG-1106G（深圳市凯沃尔电子有限公司）；动物呼吸肌ALC-V108（上海奥尔科特生物科技有限公司）。

1.3 造模与分组 造模参照汪谦的方法［7］。10%水合氯醛麻醉0.3 mL/100 g腹腔注射进行大鼠麻醉。麻醉后，气管插管并接动物呼吸机，频率70～80次/min，潮气量5～6 mL/100 g，然后进行造模，以心电图、结扎下段血管形态及心肌发绀情况判断造模是否成功。结扎阻断血流40 min后，恢复心肌灌流1 h，之后腹主动脉取血，摘取心脏。随机将大鼠分为4组，假手术组、模型组、针刺内关穴组、针刺环跳穴组，每组10只。各组处理方法参照汪谦的方法［7］，假手术组和模型组饲养至第7日，其中假手术组开胸，左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿线不结扎，40 min后，再灌注60 min，记录心电图，模型组左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿线结扎，结扎 40 min后，再灌注 60 min，记录心电图。电针内关穴组和电针环跳穴组在进行心肌缺血再灌注损伤造模之前7 d，每天给予电针刺激，分别针刺双侧“内关”和“环跳”连接SDZ-V型电子针疗仪（10 HZ，疏密波），时间20 min，每日1次，共针刺7次后再行造模。

1.4 观察指标 心电图Ⅱ导联T波观察，分别打印各组大鼠术前、结扎后1 min、结扎后40 min、再灌注后60 min心电图图纸，选取Ⅱ导联T波电压作为观察指标，量取每只大鼠连续10个心动区间的T波电压值，并计算出10个心动区间T波的平均值。光镜及电镜观察大鼠左心室缺血心肌细胞形态学的变化。标本采集：各组大鼠分别在造模结束后取材，用眼科小剪刀取下左冠状动脉前将降支穿线（假手术组）或结扎（模型组、电针内关组及电针环跳组）下段左心室心肌组织，将剪取的心肌组织迅速以冰冷的0.9%氯化钠注射液洗净，并分成两份，将其中一份心肌组织迅速修成5 mm× 1 mm×1 mm组织块（约距心尖3～5 mm区域）后浸入2.5%戊二醛固定24 h（4℃）用于观察左心室缺血区组织超微结构；另一份心肌组织迅速放入含有0.1%DEPC的4%多聚甲醇固定液中固定，用于HE染色及免疫组化检测。硝酸还原酶化学比色法测NO、NOS按一氧化氮及一氧化氮合酶试剂盒检测步骤，测定NO、NOS活性以及组织蛋白含量。免疫组化法检测心肌组织腺苷A1受体含量。

1.5 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 电针内关穴对大鼠心电图T波的影响 见表1。各组大鼠术前T波电压比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后各组大鼠与假手术组大鼠比较差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），表明造模成功。结扎后40 min与再灌注60 min：与模型组比较，电针内关组T波均明显下降（P＜0.01），而环跳组与模型组之间无显著差异（P＞0.05），与内关组比较，环跳组T波均明显升高（P＜0.01）。结果提示：电针内关穴预处理能改善心肌缺血再灌注大鼠心电图T波。

表1 各组大鼠结扎后T波比较（±s）

表1 各组大鼠结扎后T波比较（±s）

与假手术比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与电针内关组比较，※P＜0.01。下同。

组别 n 结扎前 结扎后1 min结扎后40 min再灌后60 min假手术组 10模型组 10电针内关穴组 10 0.203±0.021 0.284±0.033 0.282±0.023 0.277±0.023 0.208±0.024 0.419±0.044*0.638±0.040*0.416±0.042*0.207±0.022 0.388±0.043*0.494±0.039*△0.362±0.049**△电针环跳组 100.209±0.017 0.418±0.041*0.608±0.066*※0.411±0.046*※

2.2 电针内关穴对大鼠心肌组织超微结构的影响见图1。假手术组肌纤维排列整齐，线粒体比较丰富，线粒体嵴数目较多，嵴突呈大致平行片层状排列；模型组肌丝溶解，线粒体结构紊乱、空泡变、灶性空化，线粒体嵴致密变性明显；“内关”组肌纤维排列较整齐，线粒体基本正常，仅见部分轻度水肿；“环跳”组肌丝有溶解，线粒体结构紊乱、水肿、空泡比较明显。表明电针内关预处理对心肌细胞细胞具有保护作用。

2.3 电针内关对MIRI大鼠NO、NOS含量的影响 见表2。模型组大鼠血清NO、NOS的含量与假手术组大鼠比较显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；电针内关穴组大鼠血清中NO、NOS含量与模型组大鼠比较显著升高（P＜0.01）；电针内关穴组血清NO、NOS含量电针环跳组明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；电针环跳穴大鼠与模型组大鼠差异无统计学意义（P＞0.05）。结果提示：电针内关穴可有效升高心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中NO的含量以及NOS的活性。

图1 电针内关穴对大鼠心肌组织超微结构的影响（5000倍）

表2 各组大鼠血清NO、NOS含量比较（μmol/L，±s）

表2 各组大鼠血清NO、NOS含量比较（μmol/L，±s）

与假手术比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与电针环跳组比较，▼P＜0.05，▼▼P＜0.01。下同。

组别 n NO NOS假手术组 10模型组 10电针内关穴组 10 45.000±8.010 35.436±2.137 30.516±6.241*32.236±3.182**51.748±7.18△▼37.799±1.935△▼▼电针环跳组 1038.944±14.75 34.204±3.739

2.4 电针内关穴对MIRI大鼠腺苷A1受体的影响见表3。腺苷A1受体阳性染色信号为黄色或棕黄色（深的可至褐色）染色，定位于细胞浆内。模型组平均IOD较假手术组明显下降（P＜0.01），电针内关组平均IOD较模型组明显升高（P＜0.01），与电针环跳组和假手术组相比电针内关组平均IOD明显升高（P＜0.01），而电针环跳组与模型组间无明显差异（P＞0.05），电针环跳组与假手术组间无明显差异（P＞0.05）。

表3 各组大鼠腺苷A1受体比较（±s）

表3 各组大鼠腺苷A1受体比较（±s）

组别 n 平均IOD假手术组 10模型组 10电针内关穴组 10 0.044±0.007 0.029±0.01**0.051±0.01△▼▼电针环跳组 100.031±0.015

3 讨 论

冠状动脉左前降支是左心供血最主要的血管，结扎该段血管造成大鼠心肌缺血再灌注模型是心肌保护实验中应用最广泛的模型之一。心肌缺血再灌注损伤指各种原因导致心肌供血中断，持续一定时间后恢复血供，然而心肌灌注恢复后心肌发生较血供恢复前更为严重的损伤，表现为血压骤降、心功能不全、心律失常甚至猝死等［8］。针灸预处理是指在易感人群未发病之前预先给予针灸腧穴刺激，增强机体的应变抗病能力，阻止疾病发生或减轻发病后的组织损伤程度。研究表明针灸预处理能够达到一定的防病和疾病机体保护作用。

NO是生物体内重要的信号转导分子，在神经系统中具有重要的作用，参与体内广泛的生理和病理过程。NO的合成需NOS的催化才能完成，NOS为一含铁的单氧化酶，主要分布于血管内皮细胞、神经细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等细胞内［9］，与NO共同参与调控冠脉血管的收缩与舒张，对心肌正常供血以及缺血后心肌功能的恢复具有重要作用［10-12］。一些研究发现，缺血再灌注模型组NOS活性增强、NO释放增多与心肌组织形态学异常相伴而见［13］。本研究中模型组血清NO和NOS含量明显低于假手术组，说明心肌缺血再灌注损伤能抑制NOS的活性，减少NO含量的生成；电针内关穴组NO、NOS含量明显多于模型组，说明电针内关穴可以提高NOS的活性，促进NO的生成；而电针环跳组与模型组间NOS、NO含量无明显差异，同时电针内关组与电针环跳组相比NOS、NO含量明显升高，说明内关穴对心肌损伤具有特异性的保护作用，为“胸胁内关谋”脏腑经脉理论提供依据。

腺苷是人体组织内产生的一种内源性核苷，是一种抗炎物质，对心脏功能有多方面的作用［14-15］。腺苷A1受体与腺苷的亲和力最高，主要分布于心肌细胞内，通过调节增加细胞内K+和降低慢通道Ca2+内流量而抑制窦房结自律性和降低房室结传导性［16］。有研究表明，腺苷A1受体激动剂（CCPA）通过与细胞膜上的A1受体结合，激活PKC，导致KATP通道开放，稳定线粒体膜电位和减少ROS生成，从而抑制mPTP开放，保护心肌细胞［17］。本实验中缺血再灌注组平均IOD较假手术组明显下降，说明缺血再灌注损伤会抑制腺苷A1受体的表达；电针内关组平均IOD较缺血再灌注组明显升高，与电针环跳组相比电针内关组平均IOD明显升高，电针内关组腺苷A1受体阳性率表达明显高于模型组和电针环跳穴组。以上结果说明电针内关穴预处理可以激活心肌细胞腺苷A1受体的表达，与环跳穴相比，内关穴对保护心肌细胞具有特异性作用。

以上结果说明电针内关穴预处理对MIRI大鼠的心肌有保护作用，其可能作用机制是针灸内关预处理通过诱导腺苷A1受体的表达，从而增强NOS活性、提高NO含量有关，进而达到减轻心肌细胞损伤的目的，同时也进一步说明了内关治疗胸胁部疾病的特异性。内关穴为手厥阴心包经的络穴，又是八脉交会穴，与阴维脉相通。手厥阴心包经起于胸中，出属心包络，向下通过横膈，从胸至腹依次联络上、中、下三焦，为经脉脏腑相关理论及针灸“治未病”，“胸胁内关谋”理论在临床的应用提供依据，从而更好地指导我们临床上应用电针内关治疗心血管疾病。

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Effects of Electroacupuncture at Neiguan Point on NO，NOS and Adenosine A1 Receptors in Rats with Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

SONG Jin，WANG Chao，YANG Renda，et al. College of Acupuncture and Massage，Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

Objective：To explore the cardioprotective mechanisms of electroacupuncture（EA）at Neiguan point and observe the effect of it on NO，NOS and adenosine A1 receptors in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury（MIRI）.Methods：40 SD male rats were randomly divided into the sham group，model group，EA Neiguan group and EA Huantiao group，10 rats in each group.The models were established by ligating the coronary artery，The EA Neiguan group and EA Huantiao group were given electroacupuncture stimulation pretreatment 20 min every day lasting for 7 days before establishing MIRI model respectively.II T wave of lead electrocardiogram（ecg）before and after model was recorded，transmission electron microscopy（sem）was used to detect myocardial pathomorphism changes.The content of serum NO and NOS was determined by ELISA method，Immunohistochemical method was used to detect the contents of myocardial tissue adenosine A1 receptors.Results：NO，NOS and adenosine A1 receptors of the model group decreased significantly than those of control sham-operation group with obviously statistical difference（P＜0.05）；NO，NOS contents and adenosine A1 receptors of EA Neiguan group increased significantly than those of model group，control sham-operation group and EA Huantiao group with statistical difference（P＜0.01 or P＜0.05）；but there was no significant difference between model group and EA Huantiao group（P＞0.05）.Conclusion：The EA at Neiguan point can improve the MIRI and shows cardioprotective effects.

Myocardial ischemia-reperfusion injury；Electroacupuncture；Neiguan point；NOS；Adenosine A1 receptors

R245.9+7

A

1004-745X（2017）04-0565-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.04.001

2017-01-10）

国家自然科学基金项目（81574080）；湖南省中管局课题 （2015211）；湖南省高校创新平台开放基金项目（15k093）；2015年针灸推拿学湖南省“十二五”重点学科开放基金资助项目（序号：06）

△通信作者（电子邮箱：592436380@qq.com）