大鼠MK-shRNA腺病毒表达载体的构建

吴晓冬，薄立华，王小昆，朱 辉

(1.吉林大学中日联谊医院 科学研究中心，吉林 长春130033；2.吉林大学第一医院 神经内科，吉林 长春130021)

大鼠MK-shRNA腺病毒表达载体的构建

吴晓冬1，薄立华1，王小昆1，朱 辉2*

(1.吉林大学中日联谊医院 科学研究中心，吉林 长春130033；2.吉林大学第一医院 神经内科，吉林 长春130021)

Midkine(MK)基因是在1988年日本学者Kadomatsu[1]等发现的一种cDNA 克隆。其表达产物在胚胎发育早期至中期时在多种组织中表达，但随着胚胎的发育而逐渐减少，在成体鼠只有肾脏和子宫两个脏器有表达。因为能与肝素结合并相互作用，又被称为肝素结合生长因子。MK在神经系统的发育生长中有诸多功能[2]，本课题组也已经证明在脑缺血的急性期其表达增高[3]，近年也相继报道MK在多种肿瘤组织中有高表达[4]。

RNA干扰(RNA interference RNAi)[5]技术可高效、特异地阻断靶基因的表达。另外腺病毒载体导入效率高，靶细胞种类多，突变的可能性低，安全性相对较好。目前还未见有关在大鼠脑缺血中RNA干扰MK表达的研究，本实验针对大鼠MK基因mRNA序列选取两条靶序列，合成MK-shRNA，并且构建了腺病毒载体pAd-MK-shRNA，为进一步建立下调MK基因表达的动物模型及其MK功能的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

MK基因寡核苷酸序列由genepharma公司合成;腺病毒载体ADV1购于genepharma;T4 DNA连接酶、EcoRI 和BamHI内切酶、琼脂糖回收试剂盒等分生试剂均购自Promega公司。

1.2 方法1.2.1 针对靶序列，设计合成寡核苷酸对 从Genebank大鼠MK基因mRNA序列中挑选出两条符合要求的靶序列(位置分别在242和312处)，MK1-Rat-242:GCAAATACAAGTTTGAGAGCT、MK2-Rat-312:GAAGAAGGCTCGGTACAATGC、同时设定对照ADV1-NC：TTCTCCGAACGTGTCACGT。分别对每条靶序列设计出茎环结构样的正义链与反义链:MK-shRNA-242的正义链:5′-AATTCGCAAATACAAGTTTGAGAGCTTTCAAGAGAAGCTCT-AAACTTGTATTTGCTTTTTTG-3′;反义链-5′-GATCCAAAAAAGCAAATACAAGTTTGAGA-GCTTCTCTTGAAAGCTCTCAAACTTGTATT-TGCG-3′；MK-shRNA-312正义链：5′- AATTCGAAGAAGGCTCGGTACAATGCTTCAAGAG-AGCATTGTACCGAGCCTTCTTCTTTTTTG-3′和反义链 5′- GATCCAAAAAAGAAGAAGGCTCGGTACAATGCTCTCTTGAAGCATTGT-ACCGAGCCTTCTTCG-3′。其中在正义链的5’端添加EcoRI 酶切位点AATTC；在反义链的 5’端添加内切酶 BamHI 酶切位点GATCC。最终MK-shRNA的茎环结构为正义链: 5′-AATTC-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(N18C)-TTTTTTG- 3′；反义链: 3′-G(CN18)-(AAGTTCTCT)-(N18G)-AAAAAACCTAG-5′。

分别将合成的两对MK-shRNA茎环结构的正义链和反义链用 TE(pH8.0)溶解，浓度为 100 μM。形成双链反应体系：10×缓冲液 5 μl；MK-shRNA正义链(100 μM) 5 μl；MK-shRNA反义链(100 μM) 5 μl；ddH2O 35 μl 共50 μl反应体系。设定温度95℃ 5 min; 85℃ 5 min; 75℃ 5 min; 70℃ 5 min;最后4℃。将所得到的MK-shRNA-242和MK-shRNA-312的双链模板溶液稀释至终浓度为200 nM，用于与线性载体连接。

1.2.2 载体的酶切、纯化回收 取 10 μg ADV1 载体，用EcoRI 和BamHI进行37℃ 酶切过夜，1%琼脂糖电泳，回收纯化线性载体ADV1，稀释浓度至 50 ng/μl。

1.2.3 pAd-MK-shRNA 载体的构建 双链MK-shRNA-242和 MK-shRNA-312分别与ADV1载体连接，构建载体pAd-MK-shRNA242和pAd-MK-shRNA312：10×T4连接缓冲液 2 μl；酶切回收的线性载体ADV1(50 ng/μl) 1 μl；双链MK-shRNA 模板( 100 nM) 1 μl；T4 DNA连接酶( 5 U/μl) 1 μl；ddH2O 15 μl，共20 ul体系。22℃ 1 h，分别转化制备的Top10感受态细胞。37℃培养16 h。

1.2.4 大鼠pAd-MK-shRNA表达载体筛选和鉴定 从每块平板上挑取5个菌落，接种到含 50 μg/ml Ampicillin 的LB 培养基中，37℃培养 16 h。用质粒抽提试剂盒取一部分质粒进行测序鉴定。

2 结果

2.1 载体ADV1酶切 用内切酶EcoRI 和BamHI对载体ADV1进行酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，得到线性化的载体片段，见图1。

2.2 DNA测序

对构建的两个大鼠MK-shRNA表达载体pAd-MK-shRNA242和 pAd-MK-shRNA312，分别进行测序，序列与所设计的序列完全一致，证实MK正确插入ADV1载体中，见图2。

图1 EcoRI 和BamHI 双酶切ADV1载体

pAd-MK-shRNA242：

pAd-MK-shRNA312

图2 载体pAd-MK-shRNA的DNA测序结果

3 讨论

Midkine(MK)和Pleiotrophin(PTN)是一类肝素结合生长因子家族仅有的两个成员。它们在胚胎发育和肿瘤发生中具有重要作用。MK是分泌型蛋白，富含碱性氨基酸残基，含有10个半胱氨酸，组成5对二硫键。MK在神经系统的发育生长中有诸多功能，如：促进神经细胞生长存活、促进神经轴突生长的神经营养因子，能显著提高中脑的多巴胺性的神经元生存能力等。MK还是与多种细胞分化、增殖、修复及血管生成有关的生长因子[2]。另外MK现已研究证实其在许多肿瘤中也都有表达的改变[4]，诸如结直肠癌、胃癌、肺癌等等。

RNA干扰(RNA interference，RNAi )[5]是一种新兴的高效特异的基因阻断技术，其机制是双链RNA介导的同源信使RNA(mRNA)序列高效特异性降解的现象，从而特异地抑制靶基因的表达，同时不影响其他基因功能。Elbashir等[6]证实导入长度为21-25nt 的双链小分子RNA恰好能在哺乳动物细胞内特异地抑制靶基因表达，故而利用短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)，成为人工诱导RNAi基因沉默的一种常用方法。shRNA是由单个转录单位产生，通常不激活动物细胞的干扰素应答毒性，shRNA结构更稳定，使用更有优势。人工合成shRNA治疗一直被认为是一种很有前途的方法，所以该技术已经被广泛用于探索基因功能和恶性肿瘤的治疗领域。

腺病毒载体除了有转染效率高、副作用少等优点外，其缺点主要是在体内可诱导免疫反应，而中枢神经系统刚好是一个免疫获免区，且腺病毒表达持续时间较短，属于瞬间表达，故其在脑缺血急性期的基因治疗中将会更有发展潜力。而且，分析缺血半暗带脑血流后发现，基因转染后脑血流阈值可达到静息状态下的40%，提示对缺血半暗带进行基因转染治疗脑梗塞可行。将腺病毒载体注射到侧脑室，侧脑室壁细胞可以长期表达转染基因。如在侧脑室进行白介素1受体拮抗剂基因转染，可减小脑梗塞面积[7]。因此，可以通过抗炎细胞因子或生长因子的基因转染来治疗脑缺血。Ronit[8]在大鼠右侧大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAo)造成局灶性缺血90 min后，皮质注射携带对神经元有保护作用的胶质细胞源神经营养因子(GDNF)的腺病毒载体，证明了可以减少大脑皮质的梗死体积。

我们对Midkine已经进行了多年的研究，构建了Midkine的原核表达载体[9]，在大肠杆菌中进行表达，得到了纯化的Midkine蛋白质，并且进行了Midkine在局灶性脑缺血中的表达研究，结果在正常大鼠脑组织中没有Midkine的表达，只是在胎鼠脑组织中有强表达，在局灶性脑缺血后1天即有Midkine的表达，14天无Midkine表达[3]，我们的研究结果表明Midkine是一种即时表达因子，参与脑缺血急性期的修复。由此考虑Midkine是一种可用于脑缺血治疗的因子。本次我们设计了两条干扰序列，合成构建了两条大鼠MK-shRNA腺病毒表达载体：pAd-MK-shRNA242和pAd-MK-shRNA312，通过测序证明构建成功，腺病毒载体中加载了GFP和Amp基因，更有利于筛选验证，为后续应用到大鼠MCAO模型动物实验，为深入研究MK基因的功能和作用机制打下了良好的基础。

[1]Kadomatsu K,Tomomura M， Muramatsu T，et al.cDNA Cloning and sequencing of a new gene intensely expressed in early differentiation stages of embryonal carcinoma cells and in mid-gestation period of mouse embryogenesis[J].Biochem Biophys Res Commun,1988，151:1312.

[2]Yoshida Y,Sakakima H,Matsuda F,et al.Midkine in repair of the injured nervous system[J].Br J Pharmacol，2014，171(4):924.

[3]朱 辉，刘 群，张淑琴,等.Midkine在局灶性脑缺血中的表达及意义[J].中风与神经疾病杂志，2002，4：223.

[4]Jones DR.Measuring midkine: the utility of midkine as a biomarker in cancer and other diseases[J].Br J Pharmacol，2014，171(12):2925.

[5]Tuschl T.Expanding small RNA interference[J].Nature Biotechnol,2002,20 (5):446.

[6]Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21 nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J].Nature,2001,411(6836):494.

[7]Ishikawa E,Ooboshi H,Kumai Y,et al.Midkine gene transfer protects against focal brain ischemia and augments neurogenesis[J].J Neurol Sci，2009， 285(1-2):78.

[8]Ronit H,Liola L,Hongein Li,et al.Need for caspases in apoptosis of trophic factor-deprived PC12 cells[J].J Neuronsci Res，1997,50:69.

[9]吴晓冬，薛立娟，杨绍娟，等.肝素结合生长因子Midkine基因在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化[J].中国免疫学杂志，2006，22(4)：346.

吉林省科技发展计划项目(20120704)

*通讯作者

1007-4287(2017)05-0904-03

2016-10-17)