石榴渣多酚提取及抗氧化活性研究

赵光远,许艳华,陈美丽,纵 伟,*

(1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州 450002;2.食品生产与安全河南省协同创新中心,河南郑州 450002)

石榴渣多酚提取及抗氧化活性研究

赵光远1,2,许艳华1,2,陈美丽1,2,纵 伟1,2,*

(1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州 450002;2.食品生产与安全河南省协同创新中心,河南郑州 450002)

以石榴渣为实验原料,优化石榴渣多酚提取的工艺,并研究它的抗氧化性质。在单因素实验的基础上,利用响应面分析法(Response Surface Methodology,RSM)中的中心组合设计对石榴渣多酚的提取条件进行优化。用传统的溶剂提取法提取石榴渣中的多酚类物质,并利用福林酚法测定其含量。其抗氧化性用DPPH自由基清除能力和还原能力来评价。结果表明,最佳的石榴渣提取工艺条件是:41%的乙醇作溶剂,液料比20 mL/g,在62 ℃下提取3.5 h时多酚的得率最大为4.88 mg GAE/g,与预测值 5.034 mg GAE/g接近。石榴渣多酚有较强的DPPH自由基清除率,且总抗氧化性与提取的石榴渣多酚浓度呈正相关,相关系数为0.9988。

石榴渣，响应面法，多酚，抗氧化

活性氧,如过氧化氢、超氧阴离子、羟基自由基等是身体内基础生理代谢过程中产生的[1]。虽然正常的细胞活动需要活性氧的参与,但过多的活性氧会破坏所有类型大分子的结构,包括碳水化合物、蛋白质、核酸和脂肪。抗氧化剂可以抑制氧化过程,防止体内自由基的形成[2],已发现多酚可以作为抗氧化剂来抵抗有自由基诱导的疾病[3-4]。因此,抗氧化剂在维持身体健康和预防疾病方面越来越受到关注。

石榴(PunicagranntumL.)是一种古老、独特而神秘的水果,主要种植在亚洲、北非和中东部分地区[5-6]。石榴一般用于直接食用,或加工成饮料饮用,已报道石榴具有抗病毒和抗癌的作用[7]。石榴渣作为石榴汁生产过程中的副产物,其含有大量的抗炎症成分、抗氧化物、维生素E、甾醇类物质和石榴酸[8-12]。然而,在过去的几年研究里,人们主要侧重于对石榴皮的研究,所以本文采用响应面分析法对石榴渣多酚的提取条件进行优化,得到的多酚得率最大为4.88 mg GAE/g,以期为石榴的综合开发利用提供一定的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石榴 当地的超市,石榴要求外观完整,无破裂,八成熟。石榴剥皮后放入原汁机中榨汁,将石榴渣(包含石榴籽)放入真空冷冻干燥机中干燥24 h(真空度为:1 pa,温度为:-65 ℃),分水含量约为1%,最后石榴渣状态为无明显可见的大颗粒即可。福林酚(Folin-Ciocalteu)(纯度为99%)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(纯度大于98%) 美国Sigma公司,其他试剂均为分析纯。

XY-FD-18真空冷冻干燥机 上海欣谕仪器有限公司;SHA-C水浴恒温振荡器 金坛市中大仪器厂;752紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限责任公司;HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中挂科学仪器有限公司;SHZ-95B型循环水式多用真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚莱生化仪器厂;J2Y-13.3E原汁机 中山市金正生活电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 石榴渣中酚类物质的提取方法 称取4 g的石榴渣加入一定浓度(40%、70%、100%)的乙醇溶剂,在不同温度(25、45、65 ℃)下水浴震荡提取不同时间(0.5、2、3.5 h)后进行抽滤,然后定容到100 mL,备用。

1.2.2 酚类物质含量的测定 酚类物质含量的测定采用福林-酚比色法:移液枪吸取0.3 mL的提取液与25 mL的比色管中,加蒸馏水至10 mL,接着加入0.5 mL的福林酚试剂后,振荡5 min,再加入5%的碳酸钠溶液5 mL,加入蒸馏水至反应体系25 mL,摇匀,室温下静置90 min,在750 nm波长下测定吸光度。同时用蒸馏水作空白对照,每个样品重复三次。采用没食子酸为对照品,根据所得标准曲线算出石榴渣中提取液多酚的含量,以没食子酸当量表示,单位为:mg/g。

Y(mg/g)=C×V/M

式中:C为提取液多酚质量体积分数,mg/mL;V为提取液定容后体积,mL;M为石榴渣质量(g)。

1.2.3 石榴渣提取物的制备 准确称取10 g的石榴渣于烧瓶中,加入200 mL 42%的乙醇溶液,在62 ℃下水浴3.5 h,然后用真空泵进行抽滤处理,收集到的滤液用旋转蒸发仪除去多余的乙醇,最后用真空冷冻干燥机干燥至恒重,得到的石榴渣提取物进行抗氧化实验。

1.2.4 石榴渣多酚抗氧化性测定

1.2.4.1 石榴渣酚类物质对DPPH自由基的清除能力测定 准确量取2 mL的样液,加入2 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液,混合均匀,黑暗处反应30 min,以无水乙醇调零,测定其在517 nm处的吸光度值Ai;同时测定2 mL样品溶液与2 mL无水乙醇混合液在517 nm处的吸光度值Ac;再测定2 mL DPPH溶液与2 mL无水乙醇混合液在517 nm处的吸光度值Aj。同一测定重复操作三次。计算清除率E[13]。

E(%)=[1-(Ai-Ac)/Aj]×100

1.2.4.2 还原能力的测定 量取0.5 mL的样液于具塞试管中,加入0.2 mol/L,pH为6.6的磷酸缓冲液(将2.6865 g的Na2HPO4和1.9506 g的NaH2PO4溶解定容于100 mL的容量瓶中)2.5 mL和2.5 mL 1%的K3[Fe(CN)6],置于50 ℃恒温水浴中反应20 min,然后迅速冷却至室温,加入2.5 mL10%的三氯乙酸(trichloroacetonitrile,TCA)溶液,于3000 r/min下离心10 min后取上清液2.5 mL,并加入2.5 mL的蒸馏水及0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,混合均匀,10 min后于700 nm下测定吸光度值,同时作空白管调零。同一测定重复操作三次[14-15]。吸光度值越大表示还原能力越强。

1.2.5 响应面实验设计 响应面法是优化实验过程、描述自变量和因变量之间关系的有效方法[16]。选择时间、温度、溶剂浓度和料液比四个因素,以提取率为响应值,通过中心组合设计法(Central Composite Design,CCD)来优化提取的最佳条件。

1.2.6 数据分析 利用Design Expert 7.0分析软件及Excel程序对实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 CCD相应曲面设计优化石榴渣多酚提取工艺

根据CCD实验设计步骤进行多酚的提取,如表1所示,实验结果利用Design Expert进行分析。

表1 石榴渣多酚提取响应面实验设计及结果

2.1.1 石榴渣多酚提取工艺优化 根据CCD实验结果,进行回归分析,得多元二次回归方程:

Y=2.82+0.35A+0.60B-0.84C+0.45D+0.15AB+0.047AC+0.084AD-0.081BC+0.079BD-0.29CD+0.63A2-0.54B2-0.61C2-0.17D2

根据表2统计结果可以看出,该模型在p<0.01水平上极显著,失拟项0.1415不显著(p>0.05)说明该模型可以用于石榴渣多酚提取的优化分析,相关系数R2=0.9763,校正系数R2=0.9541,说明该模型拟合度较高,可以用于预测石榴渣多酚的优化,因素A,B,C,D,CD,A2,B2,C2影响显著(p<0.01),AB影响显著(p<0.05),AC,AD,BC,BD不显著,剔除不显著项,得到的多元回归方程为:

Y=-3.58101-1.28536A+0.14400B+0.085937C+0.18370D+5.10417×10-3AB-1.27500×10-3CD+0.27984A2-1.35088×10-3B2-6.72612×10-4C2-2.93957×10-3D2

表2 二次回归的方差分析

从图1响应面图可以看出各因素的交互作用对石榴渣多酚得率的影响,利用Design Expert软件对多元二次方差模型进行提取条件优化,得出石榴渣的最佳提取优化条件为:41.59%的乙醇作溶剂,液料比20 mL/g,在61.80 ℃下提取3.5 h时多酚的得率最大为5.03 mg GAE/g。

进行验证实验时,为了便于操作,优化条件修改为乙醇浓度41%、液料比20 mL/g、提取温度62 ℃、提取时间3.5 h,多酚得率可达4.88 mgGAE/g,为预测值的97.02%,与预测值符合度较高,因此此实验条件可以用于石榴渣多酚提取的优化。

2.1.2 多酚含量与DPPH自由基清除能力的关系 多酚含量与DPPH自由基的清除率二者之间的相互关系如图2所示,石榴渣多酚含量与DPPH自由基清除能力大小相关性显著,且相关系数为0.9494,说明石榴渣多酚在抗氧化中起了重要作用。多酚浓度与还原能力二者之间的相互关系如图3所示,石榴渣多酚的得率与还原能力呈线性关系,且其相关系数为0.9988。

图2 提取物的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging activity of the extract

图3 石榴渣提取物的还原能力Fig.3 Reducing power of the extract from the pomegranate slag

3 讨论与结论

在先前的研究中,利用较少的参数进行提取优化,在不同的实验中对液固比、提取时间、温度和乙醇浓度进行了研究[17]。响应面法是包括液固比、提取时间、温度和乙醇浓度的一个全面的实验方法,在优化许多因素时,响应面法是优化实验过程的有效工具,RSM考虑交互作用,并在合理的范围内优化参数,利用更少的重复和所需的总时间来进行实验[18-19]。

从三维响应面图,如图1所示,我们可以更好地理解变量之间的相互关系。在本研究中,可以发现四个因素都是显著的。

为评估石榴渣的抗氧化性,本研究利用DPPH自由基清除能力和还原能力两种实验,这众多测定抗氧化方法中被普遍接受的两种评价方法。

石榴渣多酚的提取条件可以通过响应面法进行优化,实验表明最佳的石榴渣提取工艺条件是:41%的乙醇作溶剂,液料比20 mL/g,在62 ℃下提取3.5 h时多酚的得率最大为4.88 mg GAE/g。并且有很强的DPPH自由基清除能力和还原能力。因此,在医药和食品行业使用石榴渣提取物必定有很大的前景。

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Extraction and antioxidant activity of polyphenols from pomegranate slag

ZHAO Guang-yuan1,2,XU Yan-hua1,2,CHEN Mei-li1,2,ZONG Wei1,2，*

(1.College of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China;2.Collaborative Innovation Center of Food Production and Safety,Henan Province,Zhengzhou 450002,China)

To optimize the extraction of polyphenols from pomegranate seed and research its antioxidant activity.Methods:By traditional solvent extration method obtained the polyphenols in pomegranate seed,then determined by Folin-Ciocalteu(FC)method.The levels of the four variables were optimized using response surface methodology(RSM)with central composite design.The antioxidant activity was determined by 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging ability and the assays of deoxidization capability.Results:The optimal conditions were determined as follows:extraction time of 3.5 h,extraction temperature of 62 ℃,ethanol concentration of 41%,and liquid-solid of 20 mL/g.Under these condition,the extraction value of polyphenols was 4.88 mg GAE/g material,which is accordance with the predicted value 5.034 mg GAE/g material.There is a positive correlation between polyphenols concentration from pomegranate seeds and DPPH free radical scavenging,and the correlation coefficient is 0.9988.

pomegranate slag;response surface methodology;phenolics;antioxidant

2016-09-13

赵光远(1973-),男，博士，教授，主要从事果蔬深加工方向，E-mail:guangyuan-zhao@163.com。

*通讯作者:纵伟(1965-),男，博士，教授，主要从事果蔬深加工方向，E-mail:zongwei1965@126.com。

河南省食品加工过程安全控制技术创新团队(C20150024);果蔬加工高新技术(16IRTSHN010)；2015年徐州市高层次创新创业人才引进计划(2015)035号。

TS255.1

B

1002-0306(2017)05-0228-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.035