两株阳性沙门氏菌在样品中检出情况分析

2017-06-01严婷

中国高新技术企业 2017年9期

摘要：文章对两株阳性沙门氏菌在样品中的检出情况进行了分析。模拟自然条件下不同类别样品沙门氏菌染菌，采用常规培养法进行沙门氏菌的检测。6份添加鸡白痢沙门氏菌ATCC19945样品有2份检测出沙门氏菌，6份添加波恩沙门氏菌CICC21677样品有6份检测出沙门氏菌。

关键词：鸡白痢沙门氏菌；波恩沙门氏菌；沙门氏菌；检测技术；两株阳性沙门氏菌文献标识码：A

中图分类号：R155 文章编号：1009-2374（2017）08-0098-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2017.08.047

沙门氏菌（Salmonella）是重要的食源性致病菌之一，已知2500余种沙门氏菌血清型，分属于46个O群。沙门氏菌在食品中毒中占有较高比率。据报道，2014年沙门氏菌引起的食源性疾病仅次于副溶血性弧菌排第2位。在中国，由沙门氏菌引起的细菌性中毒约占中毒事件总数的70%～80%。由此可以看出，因为食品中沙门氏菌污染而造成的食源性疾病，是我国目前食品安全监管工作中的一个重要方面。

目前食品中沙门氏菌国际国内标准检测方法仍以常规培养法为主，此方法需经过预增菌培养、选择性增菌培养、划线分离、生化鉴定、血清分型流程。本研究采用常规培养法，基于模拟自然状态下样品被沙门氏菌污染的过程，在不同样品中分别添加鸡白痢沙门氏菌（Salmonella Pullorum）和波恩沙門氏菌（Salmonella Bonn），分析沙门氏菌在样品中检出情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株。鸡白痢沙门氏菌（ATCC19945）、波恩沙门氏菌（CICCC21677），均保存于本实验室。

1.1.2 主要仪器。高压灭菌锅MLS-3780（日本三洋）、生物安全柜1384（Thermofisher）、水浴锅DK-600A（上海一恒科学仪器有限公司）、培养箱DHP-9272（上海一恒科学仪器有限公司）

1.1.3 主要试剂。血平板、平板计数琼脂PCA、胰蛋白胨大豆琼脂TSA、胰蛋白胨大豆肉汤TSB、缓冲蛋白胨水BPW、mKTTn增菌肉汤、RVS增菌肉汤、HE琼脂、XLD琼脂（北京陆桥有限公司）、API20E、氧化酶试剂、麦氏比浊管（法国梅里埃公司）、沙门氏菌A～F血清（宁波天润生物药业有限公司）。

1.1.4 食品样品。

第一，生制品和冷加工食品：鸡肉、鸡蛋、色拉，鸡肉和鸡蛋自超市购买，色拉自便利店购买。

第二，热加工食品：火腿鸭、蛋糕、盒饭，火腿鸭和蛋糕自超市购买，盒饭自便利店购买。

1.2 方法

1.2.1 样品处理。

第一，生制品和冷加工食品。将鸡白痢沙门氏菌ATCC199945在血平板上复苏，将波恩沙门氏菌CICC21677在胰蛋白胨大豆琼脂上复苏，自复苏平板上挑取单个菌落均用胰蛋白胨大豆肉汤TSB 37℃培养18h。用平板计数琼脂PCA进行计数。将上述菌液立即置于5℃冰箱。PCA琼脂37℃培养24h。

待计数结果出来后，无菌称取25g样品至均质袋中，每个样品称取三份：一份中加入含有约10CFU的鸡白痢沙门氏菌ATCC19945的菌悬液；一份中加入含有约10CFU的波恩沙门氏菌CICC21677的菌悬液，混合均匀；一份样品空白，将鸡蛋和色拉置于5℃保存48h。将鸡肉置于-18℃保存48h并在加增菌液之前解冻至室温。

第二，热加工食品。将鸡白痢沙门氏菌ATCC199945在血平板上复苏，将波恩沙门氏菌CICC21677在胰蛋白胨大豆琼脂上复苏，自复苏平板上挑取单个菌落均用胰蛋白胨大豆肉汤TSB 37℃培养18h。后将菌液置于50℃水浴锅中保温90分钟。待保温结束后，立即将菌液置于5℃冰箱。30分钟后，用平板计数琼脂PCA进行计数。将上述菌液立即置于5℃冰箱。PCA琼脂37℃培养24h。

待计数结果出来后，无菌称取25g样品至均质袋中，每个样品称取三份：一份中加入含有约10CFU经加热处理过的鸡白痢沙门氏菌ATCC19945的菌悬液；一份中加入含有约10CFU经加热处理过的波恩沙门氏菌CICC21677的菌悬液，混合均匀；一份样品空白，将样品置于5℃保存24h。

1.2.2 样品检测。将1.2.1中样品按照《食品和动物饲料微生物学-沙门氏菌水平检测方法》（ISO6579：2002）进行检测。18份样品中，除不添加阳性菌的鸡蛋和色拉以及添加鸡白痢沙门氏菌的鸡蛋外，其他样品在选择性分离平板上均有典型菌落生长。

1.2.3 生化试验和血清型鉴定。自选择性分离平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种营养琼脂平板，37℃培养24±3h。用营养琼脂平板上挑取培养物，用0.85%NaCl制成0.5个麦氏浊度菌悬液，使用API20E鉴定试剂条进行鉴定。结合API20E和血清学结果，判定样品中是否检出沙门氏菌。

2 结果

6份不添加阳性菌样品均未检出沙门氏菌。添加鸡白痢沙门氏菌ATCC19945的样品中有色拉和蛋糕检出沙门氏菌，添加波恩沙门氏菌CICC21677的6份样品有6份检出沙门氏菌。

3 讨论

与预期目标相比，鸡白痢沙门氏菌ATCC19945检出率为33.3%，波恩沙门氏菌CICC21677检出率为100%。鸡白痢沙门氏菌在模拟生制品和冷加工食品以及热加工食品自然染菌中检出率都较低，波恩沙门氏菌检出率都较高，这可能跟不同类型沙门氏菌对营养需求有关系。在菌种复苏期间，鸡白痢沙门氏菌ATCC19945对营养要求较高，需在血平板上进行复苏，在胰蛋白胨大豆琼脂TSA上复苏效果较差。波恩沙门氏菌CICC21677在胰蛋白胨大豆琼脂上生长良好。

沙门氏菌是最常见的食源性致病菌之一，目前国际国内常用标准检测法有GB4789.4-2016、ISO6579-2002、FDA BAM在线第五章，GB 4789.4-2016中，样品第一步增菌时pH要求为6.6～7.0，增菌液为缓冲蛋白胨水BPW，ISO6579-2002中，除酸性食品外，对第一步增菌pH并无要求，大部分类别樣品增菌液为BPW，对特定种类食品增菌液提出了要求，FDA BAM在线第五章中，对大多数类别样品第一步增菌pH要求为6.6～7.0，不同类别的样品增菌液不一样。沙门氏菌最适生长pH为6.8～7.8。建议在样品与增菌液混合均匀后，进行pH的调节。李琼琼等发现，BPW前增菌8h沙门氏菌的平板分离效果优于前增菌18h。这可能是由于BPW为非选择性培养基，在对目标菌进行扩大培养的同时也放大了干扰菌的数量。而当干扰菌含量明显高于目标菌时，这种放大效应就更为

明显。

食品中存在大量杂菌，因此选择性平板分离培养过程中对目标菌和干扰菌的准确判断，是整个检测过程中的关键环节。对于沙门氏菌分离鉴定的相关研究通常将弗氏柠檬酸杆菌或奇异变形杆菌作为沙门氏菌检测的干扰菌。沙门氏菌常用划线分离培养基有HE、BS、XLD、沙门氏菌显色培养基。BS的选择性最差，此外，当天配制的BS平板，仅在第二天使用有效。铜绿假单胞菌在沙门氏菌的检测中存在干扰，在有铜绿假单胞菌干扰的情况下，XLD平板优于科玛嘉沙门氏菌显色培养基，其中铜绿假单胞菌和沙门氏菌在科玛嘉沙门氏菌显色培养基上具有相似的显色情况。

近年来，有少量文献报道奇异变形杆菌与沙门氏菌具有共同抗原，能够与沙门氏菌的多价血清和因子血清发生交叉凝集，引起菌种鉴定上的困难。沙门氏菌还有一些自凝菌株，方婷子等报道了一株鉴定为鼠伤寒沙门氏菌的沙门氏菌SJTUF10023在生理盐水中发生自凝。

综上所述，食品中存在大量杂菌，在进行预增菌时，BPW无选择性，不能抑制其他杂菌的生长，在某些沙门氏菌对营养要求较高的情况下，杂菌可能会成为竞争优势菌。沙门氏菌在中性pH时生长较为良好，在预增菌这一步，建议进行pH的调节。在划线分离时，弗氏柠檬酸菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌等在沙门氏菌划线分离和生化鉴定存在干扰。在实际检测工作中，应考虑到样品的特性，选择合适的选择性液体增菌培养基和选择性分离平板，在进行生化试验和血清学鉴定时，尽量多挑取一些形态，以减少样品中沙门氏菌检测的假阴性比率。沙门氏菌检测的新方法不断涌现，免疫学和分子生物学方法日趋成熟，常规培养法以其成本低等优点，在食品微生物检测中得到广泛应用，常规培养法存在较大的改进空间。本研究采用常规培养法，模拟自然环境下模拟自然条件下不同类别样品沙门氏菌染菌进行沙门氏菌检测，分析了食品中沙门氏菌检测存在的问题，具有实际应用价值。

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