复合固态发酵棉粕中盐类物质的优化

田永强， 刘惠琴， 卢燕霞， 张阿强， 陈锡明

(1.兰州交通大学 化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070；2.中国科学院 寒区旱区环境与工程研究所，甘肃 兰州 730000)

复合固态发酵棉粕中盐类物质的优化

田永强1， 刘惠琴1， 卢燕霞1， 张阿强1， 陈锡明2

(1.兰州交通大学 化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070；2.中国科学院 寒区旱区环境与工程研究所，甘肃 兰州 730000)

通过Plackett-Burman试验设计方法和DPS v7.05统计软件中的均匀设计方法研究了盐类物质对棉粕发酵底物中游离棉酚降解率的影响。Plackett-Burman试验结果表明只有生物素对降解率的影响是极显著的，其他因素均不显著，进而不能进一步通过Box-Behnken(BBD)实验来验证此试验结果。因此选出对降解率具有正效应的因素利用DPS v7.05统计软件中的均匀设计方法来研究这些因素对降解率的影响。最后得出各个因子的最佳组合：X1(尿素)1.44%，X2(柠檬酸三铵)0.20%，X3(氯化胆碱)0.20%，X4(磷酸氢二钾)0.34%，X5(硫酸镁)1.00%，X6(硫酸铜)1.00%，X7(硫酸锰)1.00%，X8(硫酸锌)0.10%。

盐类物质；固态发酵；棉粕；游离棉酚

棉粕是一种富含蛋白质的植物性饲料源，但其含有毒性较高的游离棉酚、环丙烯脂肪酸、植酸等抗营养因子，限制了在畜牧养殖业中的应用[1-3]。游离棉酚是限制棉粕利用的主要因素，它的去除方法有化学法、物理法、溶剂浸提法和微生物发酵法[4-7]。通过微生物降解游离棉酚的研究始于国外[8-15],但是我国在后来逐渐建立起利用微生物固态发酵棉粕而降解游离棉酚的方法[16-24]。微生物固态发酵棉粕不仅降低了游离棉酚的含量，而且提高了发酵后棉粕的营养价值，如蛋白及多种氨基酸含量等[25-28]。但微生物发酵棉粕仍然存在许多问题，如用来发酵棉粕的菌株性能不稳定、耐受性不强、容易突变；微生物降解游离棉酚的详细机制不清楚；菌种复合发酵棉粕的过程中，一些菌群之间的协同作用或拮抗作用的机理尚不明确，缺乏充分的理论依据等[29-33]。本研究在前期发酵工艺参数优化研究的基础上，对底物中盐类物质的种类及其添加量进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试原料 棉粕、麸皮、玉米粉，均购自市场。

1.1.2 菌种 产朊假丝酵母(Candidautilis)(31272) 购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；M2 从实验室提供的棉籽壳中分离获得，鉴定为产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)。

1.1.3 试剂 正己烷，利安隆博华(天津)医药化学有限公司；异丙醇，天津市凯信化学工业有限公司；3-氨基-1-丙醇，上海麦克林生化科技有限公司；冰乙酸，利安隆博华(天津)医药化学有限公司；苯胺，上海中泰化学试剂有限公司；实验室所用试剂，均为分析纯。

1.1.4 仪器 SW-CJ-1B型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)；LDZX-50FA型高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；HNY-1102C恒温培养振荡器(天津市欧诺仪器仪表有限公司)；722s型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；JSP-100型多功能高速粉碎机(浙江省永康市金穗机械制造厂)；KDN-08A凯氏定氮仪(上海昕瑞仪器仪表有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 种子液制备 将酵母菌活化在YPD固体培养基上，28 ℃培养48 h后，用接种环挑取3环接种于50 mL YPD液体培养基中，30 ℃、150 r/min培养20 h，备用；将M2活化在LB固体培养基上，28 ℃培养36 h后，用接种环挑取3环接种于50 mL LB液体培养基中，30 ℃、150 r/min培养20 h，备用。

1.2.2 固态发酵方法 称取30 g发酵底物于480 mL组培瓶中混合均匀，121 ℃灭菌20 min，将每组的无机盐溶解于发酵底物∶水(质量比)=1∶0.75的无菌水中，然后将盐溶液加入到灭菌后的发酵底物中，搅拌均匀，按发酵底物重量4%的接种量把产朊假丝酵母和M2以体积比为7∶3的比例分别接入发酵物中，并搅拌均匀，在32.5 ℃发酵54 h后[34]，45 ℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛，将样品放入自封袋中，备用。

1.2.3 发酵底物中盐类物质添加量的优化方法 采用Mintab16.1.0软件中DOE设计下的Plackett-Burman设计14个因子2水平的试验，共20个处理组，每个处理组3个重复，测定指标为发酵底物中游离棉酚的降解率。设计参数和水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计参数和水平

通过对表2试验结果的分析得出，只有一个因素对游离棉酚降解率的影响是极显著的，不适合用Box-Behnken(BBD)实验设计来评价指标和因素间的非线性关系。因此，选出对游离棉酚的降解率有正效应的因素进行均匀优化方法优化其添加量，如表3所示，采用8因素10水平设计试验。试验采用DPS v7.05统计软件中的均匀设计方法得到均匀优化设计表U10(108)(见表4)，利用该表进行实验处理，每个处理3个重复，共计30个样本，测定指标为发酵物中游离棉酚的降解率。

表2 Plackett-Burman试验设计表及结果

表3 盐类物质添加量优化的因子与水平

注：X1为尿素，X2为柠檬酸三铵，X3为氯化胆碱，X4为磷酸氢二钾，X5为硫酸镁，X6为硫酸铜，X7为硫酸锰，X8为硫酸锌，下表同

表4 酵底物中盐类物质添加量的优化设计表U10(108)

1.2.4 指标测定方法 游离棉酚的含量具体测定方法参照国标GB13086-91，饲料中游离棉酚的测定方法参照文献[35]。游离棉酚的降解率(%)=((未发酵棉粕中游离棉酚的含量-发酵棉粕中游离棉酚的含量)/未发酵棉粕中游离棉酚的含量)×100%。活菌数的测定采用平板计数法，按照国标GB4789.15-84，食品微生物检验方法。

1.2.5 验证试验 在发酵底物中按优化后的添加量添加相应的盐，对优化结果进行验证。重复3次试验，每次三个重复。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验结果分析

Plackett-Burman试验结果见表2。通过利用Minitab软件对Plackett-Burman试验结果进行分析，如表5所示，其标准偏差为7.336 02，预测误差平方和为4 305.37，回归方程的系数R2=0.863 5，调整后R2=0.481 3。 总体上，此结果只说明了生物素对降解率的影响是最显著的，其他因素对降解率的影响不显著，因此，选择对降解率具有正效应的8个因素(B、D、E、J、K、M、N、O)进行后续试验。导致此结果的原因可能是实验设计中因素太多，其它原因有待进一步研究。

2.2 无机盐优化试验的结果分析

如表6所示，以游离棉酚的降解率为目标函数Y，用DPS v7．05软件对降解率和因子水平的实验数据进行二次多项逐步回归分析，得到二次多项式回归方程：

Y=62.287+19.510X6-24.395X7+35.381X72-0.851X82-0.034X2X4-5.314X3X7+2.578X5X6-5.386X5X8。

表5 Plackett-Burman试验设计分析结果

注：++表示差异极显著；P为差异显著性参数

统计结果表明，该方程的决定系数R2=1.000，表明次回归方程与试验结果符合度极好，能够准确表达出因子与函数之间的关系。变量X7、X82、X2X4、X3X7、X5X8与Y呈负相关，其偏相关系数均为-1，差异极显著(P<0.01)；变量X6、X72、X5X6与Y呈正相关，其偏相关系数均为1，差异极显著(P<0.01)。根据该二次多项回归方程，DPS v7.05软件拟合的Y最高指标时各个因子组合：X1(尿素)1.44%，X2(柠檬酸三铵)0.20%，X3(氯化胆碱)0.20%，X4(磷酸氢二钾)0.34%，X5(硫酸镁)1.00%，X6(硫酸铜)1.00%，X7(硫酸锰)1.00%，X8(硫酸锌)0.10%。

表6 无机盐优化试验的结果

2.3 验证试验结果

在接种量为发酵底物质量的4%，产朊假丝酵母和M2的接种比以体积比为7∶3，发酵温度32.5 ℃，发酵时间54 h，发酵底物的初始含水量75%，各种盐的添加量为尿素1.44%，柠檬酸三铵0.20%，氯化胆碱0.20%，磷酸氢二钾0.34%，硫酸镁1.00%，硫酸铜1.00%，硫酸锰1.00%，硫酸锌0.10%的最优条件下发酵棉粕，验证试验结果如表7所示。游离棉酚的降解率在最佳条件下为65.254%。

表7 验证试验结果

由表8可知，发酵前后游离棉酚的含量显著下降，从763.52 mg/kg下降到265.295 mg/kg，降解率达到65.254%。粗蛋白含量变化不明显，只升高了2.04%。一般发酵前先用分光光度计测定种子液的OD600值(1OD600=2.8×108cfu)，然后通过接种量和接种比分别算出发酵底物中的活菌数。待发酵完成后，通过平板计数法测定底物发酵后的活菌数。由表8可知发酵后的活菌数比发酵前有所增加，M2的活菌数增加了224倍，产朊假丝酵母的活菌数增加了679倍。

表8 发酵前后棉粕中游离棉酚、粗蛋白含量及活菌数

3 结 论

通过Plackett-Burman试验设计方法和DPS v7.05统计软件中的均匀设计方法研究了无机盐对棉粕发酵底物中游离棉酚降解率的影响。前期优化得出的最佳发酵条件下，即接种比7∶3(体积比)，接种量为发酵底物质量的4%，发酵底物中初始含水量为其质量的75%，发酵温度32.5 ℃，发酵时间54 h，发酵棉粕后降解率为59.031%。此条件下在底物中添加的盐：X1(尿素)1.44%，X2(柠檬酸三铵)0.20%，X3(氯化胆碱)0.20%，X4(磷酸氢二钾)0.34%，X5(硫酸镁)1.00%，X6(硫酸铜)1.00%，X7(硫酸锰)1.00%，X8(硫酸锌)0.10%，游离棉酚的降解率能达到65.254%。底物中添加盐类物质后，游离棉酚的降解率有所提升。

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Optimization of Saline Material in Composite Solid Fermentation of Cottonseed Dregs

TIAN Yong-qiang1, LIU Hui-qin1, LU Yan-xia1, ZHANG A-qiang1, CHEN Xi-ming2

(1.Coll.ofChem. &Biol.Engin.,LanzhouJiaoTongUni.,Gansu,Lanzhou730070; 2.Cold&AridReg.Environt'l&Engin.Res.Inst.,ChineseAcad.ofSci.,Gansu,Lanzhou730000)

The effect of saline material on degradation rate FG of cottonseed dregs fermentation by Plackett-Burman experimental design methods and statistical software DPS v7.05 uniform design method was studied. Plackett-Burman experimental results showed that only biotin extremely significant affects the degradation rate, other factors are not significant, and thus can not be further tests to verify the results by Box-Behnken (BBD) experiments. Therefore, the impact of these factors on the degradation rate of the selected factors had a positive effect on the degradation rate using of statistical software DPS v7.05 uniform design method. Finally, the best combination of each factor was obtained: X1(urea) 1.44%, X2(ammonium citrate) 0.20%, X3(choline chloride) 0.20%, X4(dipotassium hydrogen phosphate) 0.34%, X5(magnesium sulfate) 1.00%, X6(copper sulfate) 1.00%, X7(manganese sulfate) 1.00%, X8(zinc sulfate) 0.10%.

saline material； solid state fermentation； cottonseed dregs； free gossypol

甘肃省科技支撑计划项目(613035)

田永强 男，教授，博士，硕士生导师。从事微生物分离、鉴定和应用研究。E-mail：357181873@qq.com

2016-03-11；

2016-08-09

Q81

A

1005-7021(2017)02-0035-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.005