枇杷叶多糖纯化工艺及抗氧化活性研究

黄素华,邱丰艳,戴婉妹,洪燕萍

(龙岩学院生命科学学院,福建龙岩 364000)

枇杷叶多糖纯化工艺及抗氧化活性研究

黄素华,邱丰艳,戴婉妹,洪燕萍*

(龙岩学院生命科学学院,福建龙岩 364000)

以蛋白质和多酚的吸附率及多糖的回收率为考察指标,比较D-101、AB-8、X-5、ADS-7、ADS-17、DM-130 等6种大孔吸附树脂对枇杷叶粗多糖的纯化效果,筛选出最佳树脂并研究其优化工艺,同时采用FRAP法和DPPH法测定纯化前后多糖抗氧化活性。实验结果最佳树脂为ADS-7,最佳工艺为:上样流速1.2 BV/h,pH为13,多糖浓度24.59 mg/mL,上样量为5 BV,回收流出液,并以体积分数10%乙醇洗脱回收多糖。多糖回收率达到85%,纯度由40.4%提高到94.6%,纯化倍数2.34倍。枇杷叶多糖DPPH自由基EC50从纯化前的4.21 mg/g降低到1.64 mg/g。结论:大孔树脂吸附法可用于纯化枇杷叶多糖,纯化后多糖自由基清除能力也得到提高。

大孔吸附树脂,枇杷多糖,蛋白,多酚,纯化工艺,抗氧化

枇杷为蔷薇科枇杷属植物,在我国栽培历史悠久,栽培地区分布广泛,主要用于生产鲜果。枇杷果实富含人体所需的各种营养元素,是一种保健水果。其叶和果实均可入药,具止咳化痰等功效[1-2],在日本,枇杷叶还制作成饮料称枇杷茶(“Biwa cha”)[3]。枇杷叶药用历史悠久,作为一种传统的中药材广泛使用。由于枇把叶具有高效、低毒的特点,对其活性成分、作用机理及其药理作用的研究已引起人们的广泛关注。其主要化学成分如三萜酸、黄酮、多酚等具有止咳、祛痰、抗炎、降血糖、抗肿瘤等药理活性[4-6],并具有较强的抗氧化能力[7]。枇杷叶提取物既可作为药物原料,也可作为食品添加剂。枇杷叶多糖主要有抗肿瘤、抗炎、降血糖、抗氧化等活性,特别是在免疫调节方面的作用,使其成为当前生物活性物质研究的热点之一[8]。枇杷叶多糖常用水提醇沉法获取粗多糖,以不同浓度乙醇沉淀可以分别获得或分级分离不同性质或不同分子量的多糖[9-12]。水提醇沉获取的枇杷多糖中,通常都含有大量的蛋白质以及多酚等色素物质,在分离多糖前一般需要先进行脱蛋白和脱色处理。多糖脱蛋白主要方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等[13],由于操作中需用到大量有机溶剂,容易对环境造成污染,同时操作也较为复杂,多糖损失也较大[14-15]。

大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂,广泛应用于环境、食品、生物医药等领域。部分大孔吸附树脂可用于对吸附蛋白和多酚[16-18],也可用于多糖的分离纯化[19],与常规的多糖脱蛋白和多酚方法相比,大孔吸附树脂具有较大的优点,包括工艺简便,条件温和,树脂可再生重复使用。本研究用大孔吸附树脂纯化枇杷叶多糖,并对纯化前、后的多糖进行抗氧化研究,旨在为枇杷叶多糖的综合开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枇杷叶 采自福建龙岩红坊乡,经清洗,50 ℃烘干,粉碎,工业酒精浸提3次脱脂后烘干保存备用。大孔树脂D-101、AB-8、X-5、ADS-7、ADS-17、X-5 南开大学化工厂;树脂DM-130 山星树脂有限公司;牛血清白蛋白标准溶液 北京元亨圣马生物技术研究所;考马斯亮蓝G-250、福林酚 国药集团化学试剂有限公司;其他试剂 分析纯。

EYEL4 OIL BATH OSB-2000旋转蒸发仪 上海爱郎仪器有限公司;WFZUV-2000紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 枇杷粗多糖的制备 称取脱脂后枇杷叶干粉一定量,水煎煮2次,每次2 h,料液比分别为8∶1和6∶1,合并滤液,减压浓缩至适当浓度,加入体积分数95%乙醇至乙醇终浓度85%,静置过夜,抽滤,将所得滤饼置于60 ℃烘箱中干燥24 h,研磨得到粗多糖粉,冷藏备用。

1.2.2 多糖、蛋白质、多酚含量的测定 多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[20],测定不同浓度梯度的葡萄糖标准液493 nm下吸光度(OD)值,根据标准曲线得到相应的浓度;蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[21],在595 nm下测定不同浓度梯度的牛血蛋白标准液OD值,根据标准曲线得到相应的浓度;多酚含量测定采用福林酚氧化法[7],在760 nm下测定不同浓度梯度没食子酸母液为标准品OD值。根据标准曲线得到相应的浓度。

1.2.3 6种大孔吸附树脂吸附等温线 分别取10～40 g粗多糖,用500 mL沸水溶解,配制10个不同浓度枇杷多糖提取液。取20 mL,分别加入预处理过的D-101、AB-8、X-5、ADS-7、ADS-17和DM-130等 6种大孔吸附树脂各1.00 g(抽干后称1.00 g湿重),110 r/min 25 ℃振荡15 h后,取适量溶液,分别测定多糖、蛋白质和多酚的吸附量,绘制多糖、蛋白质和多酚的吸附等温线,计算吸附等温线公式,根据吸附等温线参数推断最佳吸附树脂,并根据等温线走势推断粗多糖的最佳上样浓度。

1.2.4 目的树脂ADS-7静态行为考察

1.2.4.1 目的树脂ADS-7吸附动力曲线的测定 称取筛选的ADS-7大孔树脂1.00 g(湿重),置100 mL具塞锥形瓶中,分别加入适当浓度粗多糖20 mL,恒温25 ℃,每20 min摇动一次。每隔1 h取上清液测定吸光度值,共连续测9 h,计算静态吸附量。

1.2.4.2 不同pH对吸附的影响 取适量粗多糖粉沸水中溶解后,分别调节pH为3、5、7、9、11、13,各取20 mL,然后各加入1.00 g的ADS-7,120 r/min震荡15 h。吸附平衡后抽滤,滤液调节至中性,分别测量多糖,蛋白质和多酚的含量,以调至相同pH不加树脂的多糖溶液为参照计算吸附率。

1.2.5 ADS-7大孔树脂动态行为考察

1.2.5.1 ADS-7泄露曲线的考察根据静态吸附解吸行为结果,选取已知粗多糖的最佳上样浓度和上样条件,将溶液通过装有目的树脂的色谱柱(10 mm×300 mm),进行动态吸附,分步收集流出液,每10 mL收集1份,直至多糖、蛋白及多酚吸附饱和,测定各份流出液多糖、蛋白及多酚的吸光值,分别绘制多糖、蛋白及多酚的泄漏曲线。

1.2.5.2 ADS-7树脂的纯化效率的考察 以优化工艺上样过柱,计算多糖回收率和纯化倍数,考察回收率和纯化倍数。

1.2.6 多糖的抗氧化活性研究 采用FRAP和DPPH自由基清除率法[10]测定抗氧化活性,比较纯化前后枇杷叶多糖抗氧化活性。以FRAP法测定总还原能力,1.8 mL TPTZ工作液加0.2 mL不同浓度FeSO4(0.025～2 mmol/L),37 ℃反应10 min,593 nm测定O.D值,绘制标准曲线。取枇杷叶纯化前后多糖溶液0.2 mL加1.8 mL TPTZ工作液,同样方法测定,利用标准曲线计算FRAP值,以相当于FeSO4μmol/g干粉表示。每个样品重复三次实验。

取5个浓度多糖溶液20 μL,加1.98 mL DPPH无水乙醇溶液,反应30 min。测定517 nm O.D值,计算DPPH自由基清除率SR%,以提取物的不同浓度为横坐标,以O.D值为纵坐标作图,根据清除率线性回归曲线计算EC50(mg干粉/mL提取液)。EC50越低,自由基清除能力越大。

1.2.7 数据处理 运用SPSS 16.0 统计软件,数据用平均值±标准偏差(x±s)表示,样本组间采用单因素方差分析。以p<0.05 作为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 多糖、蛋白质和多酚标准曲线测定结果

多糖标准曲线方程为y=0.0068x-0.0214,R2=0.9994,线性范围为15.3～122.8 μg/mL;蛋白质标准曲线方程为y=0.0055x+0.0319,R2=0.9993,线性范围为20～200 μg/mL;多酚标准曲线方程为y=0.0136x+0.0153,R2=0.9994,线性范围为10～60 μg/mL。根据标准曲线计算待测样品多糖、蛋白质及多酚含量。

2.2 6种树脂25 ℃静态吸附等温线考察

吸附等温线数据可以给出关于溶质和吸附剂之间的亲和力的信息。其中朗缪尔和弗伦德力希等温线通常用来揭示线性拟合和描述溶质与树脂如何互动。用来描述溶质与树脂之间的相互作用的朗缪尔方程Ce/qe=Ce/qm+1/KLqm和弗伦德力希方程qe=aCe1/n[22]。

表1 吸附等温线参数表

式中:qe是平衡阶段的吸附能力,qm是理论上的计算最大吸附容量(干树脂对蛋白质和多糖,mg/g;干树脂对多酚,μg/g),KL是吸附平衡常数。a是弗伦德力希常数,吸附能力的一个指标。1/n是一个与巨大的吸附推动力相关的经验常数,用它来描述可支持的吸附程度,经验常数与吸附驱动力的大小相关,当1/n值在0.1和1.0之间时有利于吸附过程,且较大的a值是吸附剂具有较好吸附性能的表征。

由表1数据可知,弗伦德力希方程中,6种大孔树脂对于吸附蛋白与多酚的1/n值为基本都在0.1和1.0之间,仅X-5对多酚的吸附为0.09;在6种树脂中ADS-7树脂对于吸附蛋白与多酚的a值相对于其他树脂较大,均明显大于其他5种大孔树脂。由朗缪尔方程求得的qm为理论上的计算最大吸附容量,由表1数据可知6种树脂对多糖的吸附容量差别不大,但ADS-7大孔树脂对于蛋白和多酚的吸附容量均明显大于其他5种大孔树脂。综合考量两个方程的各参数,结果显示ADS-7大孔树脂适合于从枇杷粗多糖中吸附去除蛋白及多酚。

吸附等温线(图1)结果显示,25 ℃下ADS-7树脂静态吸附,分别在多糖19.39 mg/mL、蛋白质2.07 mg/mL、多酚1.73 mg/mL左右时相应的吸附率达到最高,分别为68.9%、74.9%和66.0%。

根据吸附等温线参数,并结合不同浓度乙醇解吸实验结果[23],可以确定,ADS-7不仅对蛋白和多酚杂质的吸附性能好,而且通过不同体积分数乙醇的洗脱,不仅可以回收多糖,而且去除蛋白及多酚杂质,即体积分数10%乙醇浓度,ADS-7的多糖回收率最高,为78%,同时相应的蛋白和多酚吸解率最低,在体积分数95%乙醇浓度下,蛋白和多酚的解吸率最高,分别为89.58%和52.98%,洗脱杂质的效果最好。综上可得,6种树脂中ADS-7对枇杷多糖及杂质吸附解吸性能最好,可以选择体积分数10%乙醇浓度进行多糖的回收,体积分数95%乙醇浓度进行除杂,可以此方案做进一步的动态实验。

图1 ADS-7吸附等温线Fig.1 Absorption isotherm of ADS-7

2.3 ADS-7静态吸附解吸性能的考察

2.3.1 ADS-7的吸附动力曲线 ADS-7的吸附动力曲线结果如图2所示,多糖、蛋白及多酚的吸附随时间变化逐渐达到平衡,其中多糖吸附在第5 h达到,蛋白质在第6 h吸附平衡,多酚在第5 h吸附平衡。

图2 树脂ADS-7的吸附动力曲线Fig.2 Dynamics curve of static adsorption of ADS-7 macroporous resins

2.3.2 pH对吸附的影响 由表2可以得出随着pH的升高,ADS-7大孔树脂对多糖的吸附没有明显变化,而对蛋白和多酚的吸附逐步提高,在pH为13时吸附蛋白和多酚的效果最好,因此选择pH为13为最佳上样的pH。

表2 不同pH对多糖、蛋白质和多酚吸附率(%)的影响

2.4 ADS-7动态行为考察

2.4.1 泄露曲线的绘制 由吸附等温线可得最佳的上样浓度为蛋白质含量2.07 mg/mL,相应粗多糖溶液配制约为22.5 g配制500 mL,由于该浓度下液体太粘稠无法上柱,因此我们选取较低浓度进行上样。分别取已知粗多糖5、10、15、20 g于500 mL沸水中溶解,做不同的梯度浓度,分别进行上样筛选,找出不会太粘稠同时尽量接近静态吸附最佳上样浓度,由实验的结果显示在10到15 g的多糖为浓度较高且不会粘稠的,取15 g的多糖粉溶解于500 mL沸水中溶解作为上样溶液。

表3 枇杷叶多糖总酚/多糖的含量及DPPH EC50/FRAP值

注：同一栏不同小写字母表示差异显著(p<0.05),不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。取已知粗多糖15 g于500 mL沸水中溶解,吸附前多糖12.09 mg/mL,蛋白1.57 mg/mL,多酚1.30 mg/mL,调节pH至13,以1.2 BV/h的流速通过装有ADS-7树脂的色谱柱(10 mm×300 mm),进行动态吸附,分部收集流出液,测定多糖、蛋白及多酚浓度,结果如图3显示:在多糖上样量分别为40、170、70 mL时,多糖、蛋白和多酚含量陡然上升,达到泄漏点,因流出液中多糖可以回收,而杂质中多酚可通过醇沉等方法去除,故本实验以去除杂蛋白为主要目的,因此以蛋白质泄漏点作为上样泄漏点的主要考察对象,此时多糖液上样170 mL,即上样量约5 BV为宜。

图3 ADS-7泄漏曲线Fig. 3 Leakage curve of ADS-7

2.4.2 ADS-7树脂的纯化效率的考察 以泄露曲线的参数,即吸附前多糖12.09 mg/mL,蛋白1.57 mg/mL,多酚1.30 mg/mL,pH13,流速1.2 BV/h,上样体积170 mL,即约5 BV,洗脱剂为10%乙醇,洗脱体积2 BV,回收洗脱液,将上样流出液与回收洗脱液合并浓缩,计算出多糖回收率85%,纯度由40.4%提高到94.6%,纯化倍数2.34。

2.5 多糖纯化前后的抗氧化活性比较

分别测定粗多糖及纯化多糖的总酚和多糖含量,并测定两者的FRAP值和DPPH EC50,结果如表3所示。枇杷叶多糖纯化前后总酚和多糖含量均差异极显著,纯化后多糖纯度提高,酚类杂质减少,同时总还原能力显著下降,而自由基清除能力上升,DPPH EC50由原来的4.21 mg/g下降至1.64 mg/g。一般认为酚类物质具有较强的还原能力,是一种抗氧化物质,而多糖与自由基清除能力有关[23],本实验的结果可以推测,酚类物质减少导致总还原能力下降,而多糖具有一定的自由基清除能力,纯化后多糖含量提高使自由基清除能力提高。

3 结论及讨论

本实验通过大孔树脂25 ℃下静态吸附等温线、静态吸附与解吸、泄露曲线的考察、动态吸附和纯化效率初步测定,初步筛选出大孔树脂吸附法纯化枇杷多糖的工艺。实验结果表明:在多糖溶液下ADS-7、ADS-17、DM-130、AB-8、X-5、D-101 6种树脂中,ADS-7吸附蛋白质和多酚的效果最好,并且在乙醇浓度为10%,多糖总回收率较高,为78%,在乙醇浓度为95%解吸蛋白和多酚的效果最好,蛋白解吸率89.58%,多酚解吸率达52.98%[24]。由实验可得pH的大小也会影响ADS-7吸附杂质的效果,其中在pH为13下吸附蛋白质和多酚的效果最好,吸附率分别为59.8%和68.5%。考察动力曲线由实验得多糖在第4 h吸附平衡,蛋白在第6 h吸附平衡,多酚在第5 h吸附平衡。绘制泄漏曲线,得到蛋白的穿透点和吸附饱和点,多糖进行回收浓缩得到纯化倍数2.34,多糖回收率85%。数次实验结果均较稳定,粗多糖干粉初始多糖含量由40.3%～57.6%,纯化后含量由94.6%～120.0%,纯化倍数2.10～2.34,纯化效果均较好,说明ADS-7大孔树脂纯化枇杷多糖效果较好,初步纯化工艺可以为工业化生产提供实验基础。

采用大孔树脂吸附法纯化枇杷多糖,进行杂蛋白和多酚的脱除,是一种较为可行的方法。黄酮等多数物质用大孔树脂吸附法分离纯化时,通常的方法是:用适宜的大孔树脂将目标物吸附,同时部分杂质一并吸附,再采用适宜的洗脱剂将目的物与杂质分别洗脱,收集目的物达到纯化的效果;而本研究中多糖的纯化主要是通过将杂质吸附而达到将多糖纯化的效果,粗多糖通过大孔树脂吸附法纯化。相关研究[24-25]认为这两种方法都是可行的,具体应根据实际情况选用适宜树脂采用适宜工艺进行纯化。

同时抗氧化活性实验显示,枇杷叶多糖具有一定的抗氧化能力,经过大孔树脂纯化后活性有自由基清除能力有所提高。说明在枇杷叶提取物中除三萜酸、黄酮等活性物质外,多糖也具有一定的潜在的利用价值。

[1]Lin S Q. World loquat production and research with special reference to China[J]. Acta Hortic,2007,750:37-44.

[2]Lin J Y,Tang C Y. Strawberry,loquat,mulberry,and bitter melon juices exhibit prophylactic effects on LPS-induced inflammation using murine peritoneal macrophages[J]. Food Chem. 2008,107(4):1587-1596.

[3]Tan H,Furuta S,Nagata T,et al.Inhibitory effects of the leaves of loquat(Eriobotrya japonica)on bone mineral density loss in ovariectomized mice and osteoclast differentiation[J]. Agric Food Chem. 2014,62(4):836-41.

[4]鞠建华,周 亮,林 耕,等. 枇杷叶中三萜酸类成分及其抗炎、镇咳活性研究[J].中国药学杂志,2003,38(10):752-757.

[5]Dufour D,Pichette A,Mshvildadze V,et al. Antioxidant,anti-inflammatory and anticancer activities of methanolic extracts from Ledum groenlandicum Retzius[J]. Ethnopharmacol,2007,111(1):22-28

[6]Wu J B,Kuo Y H,Lin C H,et al.Tormentic acid,a major component of suspension cells of Eriobotrya japonica,suppresses high-fat diet-induced diabetes and hyperlipidemia by glucose transporter 4 and AMP-activated protein kinase phosphorylation[J]. Agric Food Chem. 2014,62(44):10717-26.

[7]Hong Y P,Lin S Q,Jiang Y M,et al. Variation in contents of total phenolics and flavonoids and antioxidant activities in the leaves of 11 Eriobotrya Species[J]. Plant Foods Hum Nutr,2008,63(4):200-204.

[8]孙世杰,徐莉.多糖类对免疫系统的作用研究[J].长春中医学院学报,2000,16(1):62-63.

[9]徐建国.枇杷干叶的多糖和总黄酮提取及其抗氧化活性研究[J].林业建设,2015(5):45-53.

[10]张颖,潘俊羽.枇杷叶多糖水提醇沉法的提取条件优化[J].贵州农业科学,2014,42(6)：161-163.

[11]孙炜炜,李星,齐富友,等.枇杷叶多糖提取工艺研究[J]. 粮食与油脂,2016,29(3):81-84.

[12]何传波,魏好程,熊何健,等.枇杷叶多糖酶法提取工艺优化及其离子交换层析纯化[J].食品科学,2016,37(8):45-50.

[13]王忠震,张钱钱,昊霞,等. 白子草多糖的分离、纯化及初步分析[J].中国中药杂志,2015,40(8)：1497-1502.

[14]刘成梅,万茵,涂家财,等,百合多糖脱蛋白方法的研究[J]. 食品科学,2002,23(1):89-90.

[15]杨云,冯卫生,雷高明.大枣渣多糖精制纯化工艺的研究[J].中药材,2006,29(1):78-80.

[16]严奉伟,吴谋成,吴季勤.大孔树脂初步纯化菜籽多酚[J].中国粮油学报,2005,20(2):57-60.

[17]黄申,李炳奇,李红,等.大孔树脂吸附解吸甘草多糖效果的研究[J].时珍国医国药,2007,18(11):78-79.

[18]Xu Y,Cai F,Yu Z,et al. Optimisation of pressurised water extraction of polysaccharides from blackcurrant and its antioxidant activity[J]. Food Chem. 2016,194:650-658.

[19]Jian L J,Chang J M,Ablise M,et al. Isolation,purification,and structural elucidation of polysaccharides from Alhagi-honey[J]. Asian Nat Prod Res,2014,16(7):783-789.

[20]董群,郑丽伊,方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究[J].中国药学杂志,1996,31(9):550-553.

[21]李如亮.生物化学实验[M].武汉:武汉大学出版社,1998:57.

[22]Yang R,Meng D,Song Y,et al. Simultaneous decoloration and deproteinization of crude polysaccharide from pumpkin residues by cross-linked polystyrene macroporous resin[J]. Agric Food Chem. 2012,60(34):8450-8456.

[23]刘畅,周家春.植物多酚抗氧化性研究[J].粮食与油脂,2011(2):43-46.

[24]戴婉妹,蔡雅醇,汤灿城,等.枇杷叶多糖纯化大孔树脂种类筛选的研究[J].龙岩学院学报,2014,32(5):52-57.

[25]Yang P,Zhou M,Zhou C,et al.Separation and purification of both tea seed polysaccharide and saponin from camellia cake extract using macroporous resin[J]. Journal of Separation Science,2015,38(4):656-662.

Purification process and antioxidant activity of loquat polysaccharide

HUANG Su-hua,QIU Feng-yan,DAI Wan-mei,HONG Yan-ping*

(College of Life Science,Longyan University,Longyan 364000,China)

To study the process of purification of loquat polysaccharides by macroporous resin,the effect of deproteinization and polyphenol removal were compared among 6 kinds of macroporous resins,including D-101,AB-8,X-5,ADS-7,ADS-17,DM-130. The best macroporous resin was selected based on the adsorption rate of the protein and polyphenol,and the recovery rate of polysaccharide. The optimization process of loquat polysaccharide purification by the screening resin was studied through static and dynamic adsorption experiments. The antioxidant activity of polysaccharides before and after purified was determined by the method of FRAP and DPPH free radical scavenging. Compared with other 5 resin,ADS-7 resin was the most suitable one for preliminary purification of loquat polysaccharide. At room temperature(25 ℃),the optimization process was as follows:the velocity was 1.2 BV/h,pH was 13,polysaccharide concentration was 24.59 mg/mL,sample volume was 5 BV,eluted by 10% ethanol to recovery of polysaccharide. Based on the optimization process,85% polysaccharide could be recovered,the content of polysaccharides was up to 94.6% from 40.4%,and purification multiple was 2.34 times. The EC50of DPPH free radical of loquat polysaccharides after purified was down to 1.64 mg/g from 4.21 mg/g. Conclusion:the macroprous resin can be used to purify the loquat polysaccharides,and the purified polysaccharides had higher scavenging active of free radical than the crude polysaccharides.

macroporous resin;polysaccharide of loquat;protein;polyphenol;purification process;antioxidant

2016-09-13

黄素华(1968-)，女，硕士，副教授，研究方向：果树生物技术，天然产物提取与应用，E-mail:1007388985@qq.com。

*通讯作者:洪燕萍(1970-)，女，博士，教授，研究方向：果树生物技术，天然产物提取与应用，E-mail:Kk9096@126.com。

福建省科技计划重点项目(2012N00190)；福建省自然科学基金项(2012D100)；福建省教育厅项目(JB12204)；福建省大学生创新训练项目(201511312058)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)05-0205-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.030