米邦塔仙人掌多糖的提取纯化及体外抗氧化活性

林 款,徐丛玥,梁 征,茹 琴,李超英,2,*

(1.江汉大学武汉生物医学研究院,湖北武汉 430056;2.汉济生物科技(武汉)有限公司,湖北武汉 430075)

米邦塔仙人掌多糖的提取纯化及体外抗氧化活性

林 款1,徐丛玥1,梁 征1,茹 琴1,李超英1,2,*

(1.江汉大学武汉生物医学研究院,湖北武汉 430056;2.汉济生物科技(武汉)有限公司,湖北武汉 430075)

目的:研究米邦塔仙人掌多糖的纯化及体外抗氧化活性。方法:用水提醇沉的方法提取得到米邦塔仙人掌粗多糖polysaccharides from Opuntia Milpa Alta(MAP),MAP经过DEAE-纤维素-52柱纯化得到多糖MAP1和MAP2,经过DEAE-琼脂糖-CL-6B柱纯化得到多糖MAP3。采用凝胶渗透色谱(GPC)分析多糖的相对分子质量,采用体外抗氧化评价体系研究米邦塔仙人掌多糖抗氧化活性。结果:MAP1相对分子质量(Mn)为476.9,MAP2相对分子质量(Mn)分布为5449、9724、529 ku,MAP3相对分子质量(Mn)分布为13270、15.87、474 ku。体外抗氧化活性结果显示,MAP的总抗氧化能力最高,MAP2和MAP3对羟基自由基、超氧阴离子和DPPH自由基的清除作用均高于MAP,其中MAP2的各项抗氧化指标的活性均高于MAP3。结论:纯化后的MAP2具有较好的抗氧化活性,米邦塔仙人掌多糖体外抗氧化活性与其相对分子质量有关。

米邦塔仙人掌,多糖,纯化,相对分子质量,体外抗氧化

米邦塔仙人掌(Opuntia Milpa Alta)属仙人掌科、仙人掌属、双子叶植物,是墨西哥农业专家经过多年的种植、人工杂交、选育后培育出来的食用仙人掌品种[1]。近年来的研究表明,仙人掌的药理作用已涉及到抑菌、抗炎、免疫、降血糖、抗癌及预防心脑血管疾病等范畴[2-3]。仙人掌的诸多功效与其化学成分密切相关,主要包括多糖类、黄酮类、有机酸类、生物碱类和甾醇类等多种天然活性物质[4-5]。

从植物中提取的多糖是由多个单糖或单糖衍生物聚合而成的大分子化合物[6],具有抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、降血糖、抗病毒、抗氧化等生理活性[7-9]。目前对于米邦塔仙人掌多糖的研究大多停留在提取方法和结构分析的阶段,各实验室对米邦塔仙人掌多糖结构特征的研究结果也存在一定差异,对于多糖的相对分子质量与生理活性之间关系的研究较少[10-11]。因此,深入研究米邦塔仙人掌多糖的构效关系具有重要的意义。

自由基是机体氧化反应产生的有害物质,是慢性疾病和衰老死亡的主要参与者,对人体的健康危害极大[12],因此,一些天然有效的自由基清除剂成为了当今的研究热点。从米邦塔仙人掌中提取的多糖是一种天然的活性物质,目前其生理活性的研究主要停留在降血脂和降血糖方面[13-14],而对于米邦塔仙人掌多糖的抗氧化活性研究鲜见研究报道。本研究采用水提醇沉提取米邦塔仙人掌多糖,用阴离子交换材料纯化后分析相对分子质量,并对其体外抗氧化活性进行研究,为米邦塔仙人掌多糖的活性研究和资源利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米邦塔仙人掌 繁星花卉园艺中心;DEAE-纤维素-52、DEAE-琼脂糖-CL-6B 北京瑞达恒辉科技发展有限公司;苯酚、浓硫酸、氯化钠、Tris-HCl、氢氧化钠、水杨酸、维生素C(VC)、硫酸亚铁、邻苯三酚、无水乙醇、过氧化氢、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、D-半乳糖醛酸、阿拉伯糖、甲醇、乙醚、丙酮 国药集团化学试剂有限公司;总抗氧化能力检测试剂盒 上海源叶生物公司。

恒温加热磁力搅拌器、多功能粉碎机 河南省予华仪器有限公司;旋转蒸发仪、BSZ-100型自动部分收集器 上海亚荣生化仪器厂;冷冻干燥机 上海豫明仪器有限公司;紫外-可见分光光度计 Perkin Elmer;酶标仪、离心机 Thermo Fisher Scientific;安捷伦1100液相色谱仪 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米邦塔仙人掌粗多糖(MAP)的制备 参照文献所报道的方法并加以改进[15-16]。取新鲜的米邦塔仙人掌,洗净后切片,烘干后用粉碎机打粉,以料液比为1∶2(g/mL)加入石油醚脱脂。取脱脂后的仙人掌粉末,以1∶28(g/mL)的料液比加入蒸馏水,83 ℃搅拌3 h,离心取上清液。用旋转蒸发仪浓缩至1/4体积,加入250 U/mg的胰蛋白酶,37 ℃水浴0.5 h。向提取液中加入4倍体积的95%乙醇,静置过夜,离心得到沉淀,将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗3次,冷冻干燥后得到粗多糖样品MAP。

1.2.2 米邦塔仙人掌多糖的纯化

1.2.2.1 阴离子交换柱DEAE-纤维素-52纯化 称取0.1 g MAP,加入10 mL蒸馏水充分搅拌溶解,10000 r/min离心15 min,上清液过DEAE-纤维素-52柱。上样吸附半个小时,用蒸馏水和0.5 mol/L NaCl分别洗脱,流速2 mL/min,每管收集8 mL。用苯酚-硫酸法在482 nm处测定每管吸光度,以试管编号为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制洗脱曲线。收集合并洗脱峰段溶液,旋蒸浓缩和透析脱盐后,进行冷冻干燥得到水洗脱部分多糖MAP1和盐洗脱部分多糖MAP2[17]。

1.2.2.2 阴离子交换柱DEAE-琼脂糖-CL-6B纯化 称取0.05 g MAP,加入10 mL蒸馏水充分搅拌溶解后10000 r/min离心15 min,上清液过DEAE-琼脂糖-CL-6B柱。上样吸附半个小时,用蒸馏水洗3个柱体积,弃去,然后用0.1 mol/L NaCl洗脱,流速1.5 mL/min,每管收集6 mL。其他步骤同1.2.2.1,冷冻干燥后得到MAP3[18]。

1.2.3 总糖和糖醛酸含量的测定 分别取2 mL 0.03 mg/mL的各多糖溶液,2 mL阿拉伯糖各标准品溶液,向各管加入4%的苯酚溶液0.5 mL,迅速滴加5 mL浓硫酸,摇匀,冷却至室温,静置15 min,测定其在482 nm处的吸光度,另取2 mL蒸馏水同法操作为参比。根据标准曲线计算样品中总糖的含量[19]。

分别取1 mL 0.5 mg/mL的各多糖溶液,1 mL D-半乳糖醛酸各标准品溶液,在冰水浴中分别加入浓硫酸溶液6 mL,混匀,于80 ℃水浴加热20 min,取出后立即冷却至室温,加入0.15%咔唑溶液0.2 mL,摇匀,室温下保持2 h后,在530 nm处测定吸光度,用1 mL蒸馏水作为参比。根据标准曲线计算样品中糖醛酸的含量[20]。

1.2.4 米邦塔仙人掌多糖相对分子质量的测定

1.2.4.1 标准曲线的制作 不同分子量的葡聚糖标准品186、10、40、70、500、2000 ku,分别用流动相溶解配制成2 mg/mL的溶液,按照色谱条件在凝胶渗透色谱(GPC)上进行分析,记录洗脱峰保留时间。

1.2.4.2 样品相对分子质量(Mn)的测定 分别取米邦塔仙人掌多糖MAP1、MAP2和MAP3配制成2 mg/mL的溶液,用流动相溶解,按照色谱条件在凝胶渗透色谱(GPC)上进行分析,记录样品保留时间。由样品保留时间计算MAP1、MAP2、MAP3在凝胶柱上的洗脱体积,从而获得分配系数,通过公式换算得到米邦塔仙人掌多糖的相对分子质量Mn[21]。

1.2.4.3 凝胶渗透色谱(GPC)条件 色谱柱PL aquagel-OH MIXED(7.5 mm×300 mm,8 μm);流动相:0.05 mol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠水溶液(pH6.7)。进样量30 μL,流速0.9 mL/min,温度35 ℃,检测器为示差折光检测器。

1.2.5 米邦塔仙人掌多糖体外抗氧化活性测定

1.2.5.1 总抗氧化能力测定(ABTS法) ABTS自由基清除活性测定使用ABTS总抗氧化能力评价方法。ABTS在氧化剂的作用下生成绿色的ABTS+,使用前12～16 h将ABTS反应原液与过硫酸钾混合,用PBS稀释调整在734 nm吸光度为0.70±0.05。后添加10 μL样品或trolox标准溶液,2～6 min后在734 nm测量吸光度,结果表示为Trolox等效抗氧化能力[22]。

1.2.5.2 清除羟基自由基活性测定 向试管中加入不同浓度多糖溶液1.0 mL,FeSO4溶液(1.8 mmol/mL)2.0 mL,水杨酸-乙醇(1.8 mmol/mL)1.5 mL,最后加浓度为0.3%的H2O2溶液0.1 mL启动反应,振荡混合,37 ℃水浴保温30 min,在波长510 nm下测量吸光度值。以1.0 mL蒸馏水代替多糖溶液,其余操作同上作为空白,VC作阳性对照[23]。

清除率(%)=[(A0-AS)/A0]×100

式中,A0为空白管的吸光度,AS为样品的吸光度。

1.2.5.3 对超氧阴离子清除作用的测定 配制0.2 mL不同浓度的多糖溶液,加入5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH8.2),25 ℃水浴10 min,加入0.2 mL 6 mmol/L的邻苯三酚溶液,摇匀后每隔30 s在325 nm处测定吸光度值,4 min内测量完成。以0.1 mL水代替多糖溶液,0.2 mL水代替邻苯三酚作为参比,0.1 mL蒸馏水代替多糖溶液作对照溶液,其余同上操作,VC作阳性对照[21]。

清除率(%)=(1-样品斜率/对照斜率)×100

式中,斜率指以时间为横坐标,相应吸光度值为纵坐标进行线性回归分析,所得回归方程的斜率。

1.2.5.4 对DPPH自由基清除作用的测定 取1 mL不同浓度多糖溶液,依次加入3 mL 0.004% DPPH甲醇溶液,充分混匀,避光静置20 min后,以甲醇作空白对照,517 nm波长测吸光度,以蒸馏水代替多糖溶液作阴性对照(Aj),VC作阳性对照[24]。

清除率(%)=(1-Ai/Aj)× 100

式中,Aj为空白管的吸光度,Ai为样品的吸光度。

1.3 数据统计分析

统计学分析用SPSS19.0软件进行,实验结果以平均值±标准差表示,各组结果采用LSD显著性差异测验进行单向方差分析,显著水平为0.05,极显著水平为0.01。

2 结果与讨论

2.1 阴离子交换柱纯化米邦塔仙人掌多糖

MAP经DEAE-纤维素-52柱纯化,洗脱曲线如图1所示,1～20管用蒸馏水洗脱,21～60管用0.5 mol/L NaCl溶液洗脱,两部分均有洗脱峰出现,因此,收集水洗脱的组分MAP1和0.5 mol/L NaCl溶液洗脱的组分MAP2。根据相关文献报道,水洗脱组分MAP1可能为不带电荷的中性多糖,而MAP2为酸性多糖[25-26]。MAP1得率较低,因此不作后续抗氧化活性研究。

图1 MAP在DEAE-纤维素-52柱上的洗脱曲线Fig.1 The elution curve of MAP in column of DEAE-cellulose-52

用另外不同的DEAE-琼脂糖-CL-6B柱对MAP进行纯化,洗脱曲线如图2所示,1～65管用0.1 mol/L NaCl溶液洗脱,收集洗脱组分MAP3。根据相关文献报道,米邦塔仙人掌多糖 MAP3为酸性多糖[25]。

图2 MAP在DEAE-琼脂糖-CL-6B柱上的洗脱曲线Fig.2 The elution curve of MAP in column of DEAE-Sepharose-CL-6B

2.2 米邦塔仙人掌多糖的总糖含量

采用苯酚-硫酸法测定总糖含量,求得线性回归方程如下:y=0.01x+0.142(R2=0.999),标准品溶液的吸光度在3～60 μg/mL浓度范围内呈现良好线性关系。根据回归方程计算出MAP总糖含量为43.6%,MAP1总糖含量为10.2%,MAP2总糖含量为76.1%,MAP3总糖含量为86.95%。MAP1总糖含量较低,经过阴离子交换柱处理的多糖总糖含量有所提高。

2.3 米邦塔仙人掌多糖的糖醛酸含量

以D-半乳糖醛酸作为标准品绘制标准曲线,求得线性回归方程为:y=2.669x+0.039(R2=0.993),标准品溶液的吸光度在0.05～0.5 mg/mL浓度范围内呈现良好线性关系。计算MAP、MAP1、MAP2和MAP3的糖醛酸含量,见图3,结果表明用阴离子交换柱处理能显著提高糖醛酸的含量(p<0.01),其中MAP2糖醛酸含量最高,达到67%。分析原因为水洗脱除去了MAP中的中性多糖,剩下的酸性多糖糖醛酸含量较高,并且带有大量的正电荷,因此容易被NaCl溶液洗脱下来。

图3 米邦塔仙人掌多糖的糖醛酸含量Fig.3 The content of uronic acid in polysaccharides from Opuntia Milpa Alta

2.4 米邦塔仙人掌多糖的相对分子质量

系列标准品葡聚糖186、10、40、70、500、2000 ku保留时间和洗脱体积见表1,通过凝胶柱上的洗脱体积、凝胶柱分配系数,相对分子质量之间的计算公式,求得各项常数,得到相互之间的线性关系。

表1 标准品的GPC保留时间和洗脱体积

米邦塔仙人掌多糖MAP1、MAP2、MAP3通过凝胶渗透色谱分析,得到色谱图如图4所示,记录MAP1、MAP2、MAP3色谱峰的保留时间,计算出MAP1、MAP2、MAP3的相对分子质量(Mn)。各多糖组分分子量(Mn)分布如表2所示,其中MAP1组分较为单一,相对分子质量(Mn)较小,根据前面的测定,MAP1的总糖和糖醛酸含量均较低,因此初步推断MAP1主要成份可能是果胶酸类物质。MAP2的色谱图中出现了三个不同的峰,通过分析 MAP2主要含有三种不同相对分子质量的多糖,最大的相对分子质量(Mn)达到5449 ku。用不同的阴离子交换柱得到的MAP3也是一种杂多糖,主要的三种成分的相对分子质量(Mn)分布与MAP1较为相近,但其中的最大相对分子质量(Mn)有差异,分析原因是不同的阴离子交换材料吸附多糖的能力各不相同,所用的洗脱液浓度也不相同,因此得到的多糖相对分子质量(Mn)有所差异。较大的相对分子质量可能与米邦塔仙人掌多糖的黏度大也存在一定的关系。

表2 米邦塔仙人掌多糖的相对分子质量(Mn)

图4 MAP1(A)、MAP2(B)、MAP3(C)的GPC色谱图Fig.4 The GPC chromatograms of MAP1(A)、MAP2(B)、MAP3(C)

2.5 米邦塔仙人掌体外抗氧化活性

2.5.1 总抗氧化能力 由图5可知,米邦塔仙人掌多糖的总抗氧化能力值随着浓度的增加而增加,当浓度增加至10 mg/mL时,最大的抗氧化能力到了0.68 mmol/g。其中MAP的抗氧化能力最好,分析原因可能是粗多糖中含有酚类和色素类的小分子杂质,这些物质具有很强的还原能力,增加了粗多糖的抗氧化能力。当浓度大于4 mg/mL时,MAP2的抗氧化能力逐渐大于MAP3,这是因为MAP3具有较大的相对分子质量,较大的聚合度导致多糖结构中具有还原能力的基团没有完全显露出来,因此降低了抗氧化的能力。

图5 米邦塔仙人掌多糖的总抗氧化能力Fig.5 The total antioxidant capacity of polysaccharides

2.5.2 对羟基自由基的清除作用 由图6可知,米邦塔仙人掌多糖的清除羟基自由基能力随着浓度的增加而增加,三种多糖均具有较好的清除羟基自由基的能力。当浓度增加至6 mg/mL后,MAP2的清除效果最好,最大的清除率达到了70%。MAP和MAP2对羟基自由基清除率的IC50值分别是7.38、5.98 mg/mL。VC对羟基自由基清除率的IC50值是0.2 mg/mL,抗氧化效果优于米邦塔仙人掌多糖。MAP清除羟基自由基的能力稍低于MAP2,说明经过纯化可以提高多糖的清除羟基自由基的能力。MAP3的清除能力最弱可能是过大的相对分子质量和聚合度所导致的。因此，多糖对羟基自由基的清除能力与多糖的纯度和相对分子质量均有一定的关系。

图6 米邦塔仙人掌多糖对羟基自由基的清除率 Fig.6 The hydroxyl radical clearance rate of polysaccharides

2.5.3 对超氧阴离子的清除作用 如图7所示,同阳性对照VC相比较,米邦塔仙人掌多糖对超氧阴离子的清除效果较差。随着浓度的增加,对超氧阴离子的清除作用只有小幅度的增加,当浓度达到最大时,MAP、MAP2、MAP3的清除率仍未达到50%。MAP2和MAP3对超氧阴离子的清除活性均高于MAP,说明经过阴离子交换柱处理过的多糖对超氧阴离子的清除作用增强。结果表明米邦塔仙人掌多糖对水杨酸体系中的超氧阴离子的清除作用不明显。

图7 米邦塔仙人掌多糖对超氧阴离子的清除率Fig.7 The superoxide anion clearance rate of polysaccharides

2.5.4 对DPPH自由基的清除作用 如图8所示,同阳性对照VC相比较,米邦塔仙人掌多糖对DPPH自由基的清除效果不明显。MAP2在浓度达到10 mg/mL时,对DPPH自由基清除率达到了51%,而MAP和MAP3在浓度2～10 mg/mL范围内,对DPPH自由基清除率均低于50%。MAP2和MAP3对DPPH自由基清除率均高于MAP,说明经过纯化的多糖对DPPH自由基的清除作用增强。

图8 米邦塔仙人掌多糖对DPPH自由基的清除率Fig.8 The DPPH radical clearance rate of polysaccharides

3 结论

本研究结果表明,MAP经过阴离子交换柱的处理,可以得到初步的纯化。将得到的MAP1、MAP2和MAP3进行渗透凝胶色谱分析,表明MAP的相对分子量(Mn)为476.9 ku,是一种中性多糖,MAP2的Mn为5449、9724、529 ku,是一种酸性杂多糖。MAP3的Mn为13270、15.87、474 ku,是一种高分子量、高度聚合的酸性杂多糖。相对分子质量的测定结果与其他实验室的报道有一定的差别[15],这可能与色谱柱的测定条件和方法有关。

在体外抗氧化活性测定实验中,同VC相比,米邦塔仙人掌多糖的体外抗氧化活性较弱,而MAP2和MAP3对羟基自由基、超氧阴离子和DPPH自由基的清除作用均高于MAP,说明经过阴离子交换柱的处理后,米邦塔仙人掌多糖的体外抗氧化活性有所提高。MAP3的体外抗氧化体系中的各项指标的清除率均低于MAP2,说明多糖的抗氧化能力与相对分子质量(Mn)有很大关系,相对分子质量小的多糖具有更强的抗氧化能力。MAP的总抗氧化能力高于MAP2和MAP3,这可能归功于粗多糖中酚类等一些具有强还原能力物质的存在,因此,在后面的研究中可以对米邦塔仙人掌多糖进行进一步的分离纯化。纯化后的米邦塔仙人掌多糖具有一定的体外抗氧化活性,但对其发挥生理活性的作用机制还有待进一步的研究。

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Extraction,purification and antioxidant activity of polysaccharides from Opuntia Milpa Altainvitro

LIN Kuan1,XU Cong-yue1,LIANG Zheng1,RU Qin1,LI Chao-ying1,2,*

(1.Wuhan Institutes of Biomedical Sciences,Jianghan University,Wuhan 430056,China;2.Hanjea(Wuhan)Biological Technology Limited Liability Company,Wuhan 430075,China)

Objective:To investigate the purification of polysaccharides from Opuntia Milpa Alta and the antioxidant activityinvitro. Methods:Crude polysaccharides from Opuntia Milpa Alta(MAP)was extracted by water extraction and alcohol sedimentation. Two polysaccharides named MAP1 and MAP2 were achieved after MAP was purified through DEAE-cellulose-52,and another polysaccharide named MAP3 was achieved through DEAE-Sepharose-CL-6B. The relative molecular mass of polysaccharides was analyzed by gel permeation chromatography(GPC)and the antioxidant activity was investigatedinvitro. Results:The relative molecular mass(Mn)of MAP1 was 476.9 ku,MAP2 contained three relative molecular mass(Mn)5449,9724,529 ku,MAP3 contained 13270,15.87,474 ku. The results of antioxidant activityinvitroshowed that,MAP had the highest total antioxidant capacity,the activity of MAP2 and MAP3 were higher than MAP in scavenging hydroxyl radical,superoxide anion and DPPH radical,and MAP2 had a higher clearance rate than MAP3 in the whole antioxidant indicators. Conclusion:The results indicated that MAP2 had a better antioxidant activity,while antioxidant activity of polysaccharideinvitrowas associated with relative molecular mass.

Opuntia Milpa Alta;polysaccharides;purification;relative molecular mass;antioxidant activityinvitro

2016-10-28

林款(1990-)，女，硕士，实验员，研究方向：天然产物化学，E-mail:link.whibs@aliyun.com。

*通讯作者:李超英(1958-)，男，博士，教授，研究方向：神经系统疾病，E-mail:licy.whibs@aliyun.com。

TS201.2

A

1002-0306(2017)05-0140-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.018